Molekylær Biologi -Molecular biology

Fra Wikipedia, den frie encyklopædi

Molekylærbiologi / m ə ˈ l ɛ k j ʊ l ər / er den gren af ​​biologien, der søger at forstå det molekylære grundlag for biologisk aktivitet i og mellem celler, herunder molekylær syntese, modifikation, mekanismer og interaktioner. Studiet af biologiske makromolekylers kemiske og fysiske struktur er kendt som molekylærbiologi.

Molekylærbiologi blev først beskrevet som en tilgang fokuseret på grundlaget for biologiske fænomener - afdækning af strukturerne af biologiske molekyler såvel som deres interaktioner, og hvordan disse interaktioner forklarer observationer af klassisk biologi.

I 1945 blev udtrykket molekylærbiologi brugt af fysikeren William Astbury. Udviklingen inden for molekylærbiologi skete meget sent for at forstå, at det komplekse system eller fordelagtige tilgang ville blive lavet på en enkel måde at forstå ved at bruge bakterier og bakteriofager, denne organisme giver information om grundlæggende biologisk proces lettere end dyreceller. I 1953 lavede to unge mænd ved navn Francis Crick og James Watson, der arbejdede ved Medical Research Council-enheden, Cavendish-laboratoriet, Cambridge (nu MRC Laboratory of Molecular Biology ), en dobbelt helix-model af DNA, som ændrede hele forskningsscenariet, de foreslog DNA. struktur baseret på tidligere forskning udført af Rosalind Franklin og Maurice Wilkins, så førte forskningen til at finde DNA-materiale i andre mikroorganismer, planter og dyr.

Molekylærbiologi er ikke blot studiet af biologiske molekyler og deres interaktioner; snarere er det også en samling af teknikker udviklet siden feltets tilblivelse, som har gjort det muligt for forskere at lære om molekylære processer. En bemærkelsesværdig teknik, som har revolutioneret feltet, er polymerasekædereaktionen (PCR), som blev udviklet i 1983. PCR er en reaktion, der amplificerer små mængder DNA, og den bruges i mange applikationer på tværs af videnskabelige discipliner, som det vil blive diskuteret senere. .

Molekylærbiologiens centrale dogme beskriver den proces, hvor DNA transskriberes til RNA, som derefter oversættes til protein.

Molekylærbiologi spiller også en afgørende rolle i forståelsen af ​​strukturer, funktioner og interne kontroller inden for individuelle celler, som alle kan bruges til effektivt at målrette nye lægemidler, diagnosticere sygdom og bedre forstå cellefysiologi. Nogle kliniske undersøgelser og medicinske terapier, der stammer fra molekylærbiologi, er omfattet af genterapi, hvorimod brugen af ​​molekylærbiologi eller molekylær cellebiologi i medicin nu omtales som molekylær medicin .

Molekylærbiologiens historie

Molekylærbiologi sidder i skæringspunktet mellem biokemi og genetik; da disse videnskabelige discipliner opstod og udviklede sig i det 20. århundrede, blev det klart, at de begge søgte at bestemme de molekylære mekanismer, der ligger til grund for vitale cellulære funktioner. Fremskridt inden for molekylærbiologi har været tæt forbundet med udviklingen af ​​nye teknologier og deres optimering. Molekylærbiologi er blevet belyst af mange videnskabsmænds arbejde, og feltets historie afhænger således af en forståelse af disse videnskabsmænd og deres eksperimenter.

Det hele begynder med fænomenet transformation i bakterierne, i 1928 observerede Frederick Griffith et fænomen med transformation fra en bakterie til en anden [nu kendt som genetisk transformation]. På det tidspunkt kunne han ikke forklare fænomenet transformation. Senere i 1944 demonstrerede tre videnskabsmænd Oswald Avery, Colin Macleod og Maclyn McCarty hele fænomenet med transformation i bakterierne. Efter, to år i 1930, blev molekylærbiologi etableret som en officiel gren af ​​videnskaben. Men udtrykket "molekylær biologi" blev først opfundet i 1938, og det blev gjort af videnskabsmanden Warren Weaver, der arbejdede som direktør for naturvidenskab ved Rockefeller Foundation.

Fra det følgende eksperiment blev det konkluderet, at DNA er det grundlæggende genetiske materiale, der forårsagede de genetiske ændringer. Grundlæggende sammensætning af DNA'et var kendt, at det indeholder fire baser kendt som - Adenin, Guanin, Thymin og Cytosin. Så på grundlag af den kemiske sammensætning og røntgenkrystallografien, udført af Maurice Wilkins og Rosalind Franklin, blev DNA-strukturen foreslået af James Watson og Francis Crick. Men før Watson og Crick foreslog DNA-strukturen, foreslog den østrigsk fødte videnskabsmand Erwin Chargaff i 1950 teorien/reglen [i dag kendt som Chargaffs regel], som sagde, at antallet af adenin og thymin og guanin og cytosin er lige store. del.

Chargaffs regel

"Chargaffs regel sagde, at DNA fra enhver art af enhver organisme skulle have et støkiometrisk forhold på 1:1 af purin og pyrimidiner (dvs. A+G=T+C), og mere specifikt at mængden af ​​guanin skulle være lig med cytosin og mængden af ​​adenin bør være lig med thymin . Dette mønster findes i begge strenge af DNA'et".

Genetikområdet opstod som et forsøg på at forstå de molekylære mekanismer af genetisk arv og strukturen af ​​et gen . Gregor Mendel var banebrydende for dette arbejde i 1866, da han første gang skrev lovene om genetisk arv baseret på hans studier af parringskrydsninger i ærteplanter. En sådan lov om genetisk arv er loven om segregation, som siger, at diploide individer med to alleler for et bestemt gen vil videregive en af ​​disse alleler til deres afkom. På grund af hans kritiske arbejde er studiet af genetisk arv almindeligvis omtalt som Mendelsk genetik .

En vigtig milepæl inden for molekylærbiologi var opdagelsen af ​​DNA-strukturen. Dette arbejde begyndte i 1869 af Friedrich Miescher, en schweizisk biokemiker, som først foreslog en struktur kaldet nuclein, som vi nu ved er deoxyribonukleinsyre eller DNA. Han opdagede dette unikke stof ved at studere komponenterne i pusfyldte bandager og bemærke de unikke egenskaber ved de "phosphorholdige stoffer". En anden bemærkelsesværdig bidragyder til DNA-modellen var Phoebus Levene, som foreslog "polynukleotidmodellen" af DNA i 1919 som et resultat af hans biokemiske eksperimenter på gær. I 1950 udvidede Erwin Chargaff arbejdet med Levene og belyste et par kritiske egenskaber ved nukleinsyrer: For det første varierer nukleinsyresekvensen på tværs af arter. For det andet er den totale koncentration af puriner (adenin og guanin) altid lig med den samlede koncentration af pyrimidiner (cystein og thymin). Dette er nu kendt som Chargaffs regel. I 1953 udgav James Watson og Francis Crick den dobbelte spiralformede struktur af DNA ved hjælp af røntgenkrystallografiarbejdet udført af Rosalind Franklin og Maurice Wilkins . Watson og Crick beskrev DNA-strukturen og gættede på implikationerne af denne unikke struktur for mulige mekanismer for DNA-replikation.

JD Watson og FHC Crick blev tildelt Nobelprisen i 1962 sammen med Maurice Wilkens for at foreslå en model af DNA-strukturen.

Som tiden gik, opdagede KA Marcker og Frederick Sanger i 1964 et ejendommeligt amioacyl-tRNA i E.coli, kaldet N-formyl-methionyl – tRNA og forklarede, at dette molekyle spiller en rolle i den særlige mekanisme for kædeforlængelsen. Han blev tildelt anden Nobelpris for at opdage en komplet sekvens af 5.400 nukleotider af enkeltstrenget DNA fra F´174-bakteriofager.

I 1961 blev det påvist, at når et gen koder for et protein, specificerer tre sekventielle baser af et gens DNA hver efterfølgende aminosyre i proteinet. Den genetiske kode er således en tripletkode, hvor hver triplet (kaldet et kodon) specificerer en bestemt aminosyre. Endvidere blev det vist, at kodonerne ikke overlapper hinanden i DNA-sekvensen, der koder for et protein, og at hver sekvens aflæses fra et fast udgangspunkt.

I løbet af 1962-1964, gennem brugen af ​​betingede dødelige mutanter af en bakterievirus, blev der gjort fundamentale fremskridt i vores forståelse af funktionerne og interaktionerne mellem de proteiner, der anvendes i maskineriet til DNA-replikation, DNA-reparation, DNA-rekombination og i samlingen af molekylære strukturer.

Diagrammatisk repræsentation af Watson og Cricks DNA-struktur
Vinkelbeskrivelse i DNA-struktur

F.Griffith-eksperimentet

Diagrammatisk fremstilling af eksperimentet

I 1928 stødte Fredrick Griffith på en virulensegenskab i pneumococcus-bakterier, som dræbte laboratorierotter. Ifølge Mendel, udbredt på det tidspunkt, kunne genoverførsel kun forekomme fra forældre- til datterceller. Griffith fremførte en anden teori, og sagde, at genoverførsel, der forekommer hos medlemmer af samme generation, er kendt som horisontal genoverførsel (HGT). Dette fænomen omtales nu som genetisk transformation.

Griffith adresserede Streptococcus pneumoniae - bakterien, som havde to forskellige stammer, en virulent og glat og en avirulent og ru. Den glatte stamme havde et glitrende udseende på grund af tilstedeværelsen af ​​en type specifikt polysaccharid - en polymer af glucose og glucuronsyrekapsel. På grund af dette polysaccharidlag af bakterier kan en værts immunsystem ikke genkende bakterierne, og det dræber værten. Den anden, avirulente, ru stamme mangler denne polysaccharidkapsel og har et kedeligt, ru udseende.

Tilstedeværelse eller fravær af kapsel i stammen er kendt for at være genetisk bestemt. Glatte og ru stammer forekommer i flere forskellige typer som henholdsvis SI, S-II, S-III osv. og RI, R-II, R-III osv. Alle disse undertyper af S- og R-bakterier adskiller sig fra hinanden i antigentype, de producerer.

Hershey og Chase eksperimenterer

Hershey og Chase eksperimenterer

Bekræftelsen af, at DNA er det genetiske materiale, der er årsag til infektion, kom fra Hershey og Chase-eksperimentet. De brugte E.coli og bakteriofag til eksperimentet. Dette eksperiment er også kendt som blendereksperiment, da køkkenblender blev brugt som et vigtigt apparat. Alfred Hershey og Martha Chase demonstrerede, at det DNA, som en fagpartikel injiceret i en bakterie, indeholder al den information, der kræves for at syntetisere afkomsfagpartikler. De brugte radioaktivitet til at mærke bakteriofagens proteinkappe med radioaktivt svovl og DNA med radioaktivt fosfor i henholdsvis to forskellige reagensglas. Efter blanding af bakteriofag og E.coli i reagensglasset starter inkubationsperioden, hvor fag omdanner arvematerialet i E.coli - cellerne. Derefter blandes eller omrøres blandingen, hvilket adskiller fagen fra E.coli - celler. Hele blandingen centrifugeres, og pelleten, som indeholder E. coli- celler, blev kontrolleret, og supernatanten blev kasseret. E.coli - cellerne viste radioaktivt fosfor, hvilket indikerede, at det transformerede materiale var DNA og ikke proteinkappen.

Det transformerede DNA bliver knyttet til DNA'et fra E.coli, og radioaktivitet ses kun på bakteriofagens DNA. Dette muterede DNA kan overføres til næste generation, og teorien om transduktion opstod. Transduktion er en proces, hvor det bakterielle DNA bærer fragmentet af bakteriofager og sender det videre til næste generation. Dette er også en type horisontal genoverførsel.

Moderne molekylærbiologi

Når vi nærmer os midten af ​​20'erne, er molekylærbiologien på vej ind i en guldalder defineret af både vertikal og horisontal teknisk udvikling. Lodret giver nye teknologier mulighed for realtidsovervågning af biologiske processer på atomniveau. Molekylærbiologer har i dag adgang til stadigt mere overkommelige sekventeringsdata på stadig højere dybder, hvilket letter udviklingen af ​​nye genetiske manipulationsmetoder i nye ikke-modelorganismer. Ligeledes vil syntetiske molekylærbiologer drive den industrielle produktion af små og makromolekyler gennem introduktionen af ​​eksogene metaboliske veje i forskellige prokaryote og eukaryote cellelinjer.

Horisontalt bliver sekventering af data mere overkommelig og brugt i mange forskellige videnskabelige områder. Dette vil drive udviklingen af ​​industrier i udviklingslande og øge tilgængeligheden for individuelle forskere. Ligeledes kan CRISPR-Cas9 genredigeringseksperimenter nu udtænkes og implementeres af enkeltpersoner for under $10.000 i nye organismer, som vil drive udviklingen af ​​industrielle og medicinske applikationer

Relation til andre biologiske videnskaber

Skematisk sammenhæng mellem biokemi, genetik og molekylærbiologi

Den følgende liste beskriver et synspunkt på de tværfaglige forhold mellem molekylærbiologi og andre relaterede områder.

Mens forskere praktiserer teknikker, der er specifikke for molekylærbiologi, er det almindeligt at kombinere disse med metoder fra genetik og biokemi . Meget af molekylærbiologien er kvantitativ, og for nylig er en betydelig mængde arbejde blevet udført ved hjælp af computervidenskabelige teknikker såsom bioinformatik og beregningsbiologi . Molekylær genetik, studiet af genstruktur og funktion, har været blandt de mest fremtrædende underområder inden for molekylærbiologi siden begyndelsen af ​​2000'erne. Andre grene af biologi er informeret af molekylærbiologi, ved enten direkte at studere interaktioner mellem molekyler i deres egen ret, såsom i cellebiologi og udviklingsbiologi, eller indirekte, hvor molekylære teknikker bruges til at udlede historiske attributter for populationer eller arter, som i felter inden for evolutionær biologi såsom populationsgenetik og fylogenetik . Der er også en lang tradition for at studere biomolekyler "fra bunden" eller molekylært i biofysik .

Teknikker i molekylærbiologi

DNA animation

Molekylær kloning

Transduktionsbillede

Molekylær kloning bruges til at isolere og derefter overføre en DNA-sekvens af interesse til en plasmidvektor. Denne rekombinante DNA-teknologi blev først udviklet i 1960'erne. I denne teknik klones en DNA -sekvens, der koder for et protein af interesse, under anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR) og/eller restriktionsenzymer ind i et plasmid ( ekspressionsvektor ). Plasmidvektoren har sædvanligvis mindst 3 karakteristiske træk: et replikationsstartsted, et multiple kloningssted (MCS) og en selektiv markør (normalt antibiotikaresistens ). Derudover opstrøms for MCS er promotorregionerne og transkriptionsstartstedet, som regulerer ekspressionen af ​​klonet gen.

Dette plasmid kan indsættes i enten bakterie- eller dyreceller. Introduktion af DNA i bakterieceller kan ske ved transformation via optagelse af nøgent DNA, konjugering via celle-cellekontakt eller ved transduktion via viral vektor. Introduktion af DNA i eukaryote celler, såsom dyreceller, ved fysiske eller kemiske midler kaldes transfektion . Flere forskellige transfektionsteknikker er tilgængelige, såsom calciumphosphattransfektion, elektroporation, mikroinjektion og liposomtransfektion . Plasmidet kan integreres i genomet, hvilket resulterer i en stabil transfektion, eller det kan forblive uafhængigt af genomet og udtrykkes midlertidigt, kaldet en forbigående transfektion.

DNA, der koder for et protein af interesse, er nu inde i en celle, og proteinet kan nu udtrykkes. En række forskellige systemer, såsom inducerbare promotorer og specifikke cellesignalerende faktorer, er tilgængelige for at hjælpe med at udtrykke proteinet af interesse i høje niveauer. Store mængder af et protein kan derefter udvindes fra den bakterielle eller eukaryote celle. Proteinet kan testes for enzymatisk aktivitet under en række forskellige situationer, proteinet kan krystalliseres, så dets tertiære struktur kan studeres, eller i den farmaceutiske industri kan aktiviteten af ​​nye lægemidler mod proteinet undersøges.

Polymerase kædereaktion

Polymerasekædereaktion (PCR) er en ekstremt alsidig teknik til kopiering af DNA. Kort sagt tillader PCR en specifik DNA-sekvens at blive kopieret eller modificeret på forudbestemte måder. Reaktionen er ekstremt kraftig og kan under perfekte forhold forstærke et DNA-molekyle til at blive til 1,07 milliarder molekyler på mindre end to timer. PCR har mange anvendelser, herunder studiet af genekspression, påvisning af patogene mikroorganismer, påvisning af genetiske mutationer og introduktion af mutationer til DNA. PCR-teknikken kan bruges til at introducere restriktionsenzymsteder til ender af DNA-molekyler eller til at mutere bestemte baser af DNA, sidstnævnte er en metode, der omtales som site-directed mutagenese . PCR kan også bruges til at bestemme, om et bestemt DNA-fragment findes i et cDNA-bibliotek . PCR har mange variationer, såsom revers transkriptions-PCR ( RT-PCR ) til amplifikation af RNA, og for nyligt kvantitativ PCR, som muliggør kvantitativ måling af DNA- eller RNA-molekyler.

To procent agarosegel i boratbuffer støbt i en gelbakke.

Gelelektroforese

SDS-SIDE

Gelelektroforese er en teknik, der adskiller molekyler efter deres størrelse ved hjælp af en agarose- eller polyacrylamidgel. Denne teknik er et af de vigtigste værktøjer inden for molekylærbiologi. Grundprincippet er, at DNA-fragmenter kan adskilles ved at påføre en elektrisk strøm hen over gelen – fordi DNA-rygraden indeholder negativt ladede fosfatgrupper, vil DNA'et vandre gennem agarosegelen mod den positive ende af strømmen. Proteiner kan også adskilles på basis af størrelse ved hjælp af en SDS-PAGE gel, eller på basis af størrelse og deres elektriske ladning ved at bruge det, der er kendt som en 2D gelelektroforese .

Proteiner farvet på en PAGE gel under anvendelse af Coomassie blå farvestof.

Bradford Assay

Bradford Assay er en molekylærbiologisk teknik, som muliggør hurtig, nøjagtig kvantificering af proteinmolekyler ved at udnytte de unikke egenskaber af et farvestof kaldet Coomassie Brilliant Blue G-250. Coomassie Blue gennemgår et synligt farveskift fra rødbrun til lyseblå ved binding til protein. I sin ustabile, kationiske tilstand har Coomassie Blue en baggrundsbølgelængde på 465 nm og afgiver en rødbrun farve. Når Coomassie Blue binder til protein i en sur opløsning, skifter baggrundsbølgelængden til 595 nm, og farvestoffet afgiver en klar blå farve. Proteiner i analysen binder Coomassie blåt på ca. 2 minutter, og protein-farvestofkomplekset er stabilt i ca. en time, selvom det anbefales, at absorbansaflæsninger foretages inden for 5 til 20 minutter efter reaktionens start. Koncentrationen af ​​protein i Bradford-assayet kan derefter måles ved hjælp af et spektrofotometer for synligt lys og kræver derfor ikke omfattende udstyr.

Denne metode blev udviklet i 1975 af Marion M. Bradford og har muliggjort væsentlig hurtigere og mere nøjagtig proteinkvantificering sammenlignet med tidligere metoder: Lowry-proceduren og biuret-assayet. I modsætning til de tidligere metoder er Bradford-assayet ikke modtageligt for interferens fra flere ikke-proteinmolekyler, herunder ethanol, natriumchlorid og magnesiumchlorid. Det er dog modtageligt for påvirkning af stærke alkaliske buffermidler, såsom natriumdodecylsulfat (SDS).

Makromolekyle blotting og sondering

Begreberne northern, western og eastern blotting er afledt af, hvad der oprindeligt var en molekylærbiologisk joke, der spillede på udtrykket Southern blotting, efter den teknik, der er beskrevet af Edwin Southern til hybridisering af blottet DNA. Patricia Thomas, udvikler af RNA blot, som derefter blev kendt som northern blot, brugte faktisk ikke udtrykket.

Southern blotting

Opkaldt efter sin opfinder, biolog Edwin Southern, er Southern blot en metode til at undersøge tilstedeværelsen af ​​en specifik DNA-sekvens i en DNA-prøve. DNA-prøver før eller efter restriktionsenzym (restriktionsendonuklease) fordøjelse adskilles ved gelelektroforese og overføres derefter til en membran ved blotting via kapillærvirkning . Membranen udsættes derefter for en mærket DNA-probe, der har en komplementbasesekvens til sekvensen på DNA'et af interesse. Southern blotting er mindre almindeligt anvendt i laboratorievidenskab på grund af kapaciteten af ​​andre teknikker, såsom PCR, til at detektere specifikke DNA-sekvenser fra DNA-prøver. Disse blots bruges dog stadig til nogle applikationer, såsom måling af transgenkopiantal i transgene mus eller i konstruktionen af ​​gen-knockout embryonale stamcellelinjer .

Northern blotting

Northern blot-diagram

Northern blot bruges til at studere tilstedeværelsen af ​​specifikke RNA-molekyler som relativ sammenligning mellem et sæt af forskellige prøver af RNA . Det er i det væsentlige en kombination af denaturerende RNA-gelelektroforese og en blot . I denne proces adskilles RNA baseret på størrelse og overføres derefter til en membran, der derefter probes med et mærket komplement af en sekvens af interesse. Resultaterne kan visualiseres på en række forskellige måder afhængigt af den anvendte etiket; de fleste resulterer imidlertid i afsløringen af ​​bånd, der repræsenterer størrelserne af RNA'et påvist i prøven. Intensiteten af ​​disse bånd er relateret til mængden af ​​mål-RNA i de analyserede prøver. Proceduren bruges almindeligvis til at studere, hvornår og hvor meget genekspression der forekommer ved at måle, hvor meget af det RNA der er til stede i forskellige prøver, idet det antages, at der ikke sker nogen post-transkriptionel regulering, og at niveauerne af mRNA afspejler proportionale niveauer af det tilsvarende proteinvæsen. produceret. Det er et af de mest grundlæggende redskaber til at bestemme på hvilket tidspunkt og under hvilke forhold, visse gener udtrykkes i levende væv.

Western blotting

Et western blot er en teknik, hvorved specifikke proteiner kan påvises fra en blanding af proteiner. Western blots kan bruges til at bestemme størrelsen af ​​isolerede proteiner, såvel som til at kvantificere deres ekspression. Ved western blotting adskilles proteiner først efter størrelse i en tynd gel, der er klemt mellem to glasplader i en teknik kendt som SDS-PAGE . Proteinerne i gelen overføres derefter til en polyvinylidenfluorid (PVDF), nitrocellulose, nylon eller anden støttemembran. Denne membran kan derefter probes med opløsninger af antistoffer . Antistoffer, der specifikt binder til proteinet af interesse, kan derefter visualiseres ved en række forskellige teknikker, herunder farvede produkter, kemiluminescens eller autoradiografi . Ofte er antistofferne mærket med enzymer. Når et kemiluminescerende substrat udsættes for enzymet, tillader det påvisning. Brug af western blotting-teknikker tillader ikke kun påvisning, men også kvantitativ analyse. Analoge metoder til western blotting kan bruges til direkte at farve specifikke proteiner i levende celler eller vævssnit .

Østlig blotting

Eastern blotting - teknikken bruges til at detektere post-translationel modifikation af proteiner. Proteiner blottet på PVDF- eller nitrocellulosemembranen sonderes for modifikationer under anvendelse af specifikke substrater.

Mikroarrays

Et DNA-mikroarray bliver udskrevet
Hybridisering af mål til sonde

Et DNA-mikroarray er en samling af pletter knyttet til en fast understøtning, såsom et objektglas, hvor hver plet indeholder et eller flere enkeltstrengede DNA- oligonukleotidfragmenter . Arrays gør det muligt at nedsætte store mængder af meget små (100 mikrometer diameter) pletter på et enkelt objektglas. Hver plet har et DNA-fragmentmolekyle, der er komplementært til en enkelt DNA-sekvens . En variation af denne teknik gør det muligt at kvalificere genekspressionen af ​​en organisme på et bestemt udviklingsstadium ( ekspressionsprofilering ). I denne teknik isoleres RNA'et i et væv og omdannes til mærket komplementært DNA (cDNA). Dette cDNA hybridiseres derefter til fragmenterne på arrayet, og visualisering af hybridiseringen kan udføres. Da flere arrays kan fremstilles med nøjagtig den samme position af fragmenter, er de særligt nyttige til at sammenligne genekspressionen af ​​to forskellige væv, såsom et sundt og kræftvæv. Man kan også måle, hvilke gener der udtrykkes, og hvordan det udtryk ændrer sig med tiden eller med andre faktorer. Der er mange forskellige måder at fremstille mikroarrays på; de mest almindelige er siliciumchips, objektglas med pletter på ~100 mikrometer i diameter, tilpassede arrays og arrays med større pletter på porøse membraner (makroarrays). Der kan være alt fra 100 spots til mere end 10.000 på en given matrix. Arrays kan også laves med andre molekyler end DNA.

Allel-specifikt oligonukleotid

Allelspecifikt oligonukleotid (ASO) er en teknik, der tillader påvisning af enkeltbasemutationer uden behov for PCR eller gelelektroforese. Korte (20-25 nukleotider lange), mærkede prober udsættes for det ikke-fragmenterede mål-DNA, hybridisering sker med høj specificitet på grund af den korte længde af proberne, og selv en enkelt baseændring vil hindre hybridisering. Mål-DNA'et vaskes derefter, og de mærkede prober, der ikke hybridiserede, fjernes. Mål-DNA'et analyseres derefter for tilstedeværelsen af ​​proben via radioaktivitet eller fluorescens. I dette eksperiment, som i de fleste molekylærbiologiske teknikker, skal der bruges en kontrol for at sikre vellykket eksperimentering.

Inden for molekylærbiologi udvikles procedurer og teknologier løbende, og ældre teknologier opgives. For eksempel, før fremkomsten af ​​DNA- gelelektroforese ( agarose eller polyacrylamid ), blev størrelsen af ​​DNA-molekyler typisk bestemt ved hastighedssedimentering i saccharosegradienter , en langsom og arbejdskrævende teknik, der kræver dyr instrumentering; forud for saccharosegradienter blev viskometri anvendt. Bortset fra deres historiske interesse er det ofte værd at kende til ældre teknologi, da det af og til er nyttigt at løse et andet nyt problem, hvor den nyere teknik er uhensigtsmæssig.

Se også

Referencer

Yderligere læsning

eksterne links