Biologie moléculaire -Molecular biology

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La biologie moléculaire / m ə ˈ l ɛ k j ʊ l ər / est la branche de la biologie qui cherche à comprendre la base moléculaire de l'activité biologique dans et entre les cellules, y compris la synthèse moléculaire, la modification, les mécanismes et les interactions. L'étude de la structure chimique et physique des macromolécules biologiques est connue sous le nom de biologie moléculaire.

La biologie moléculaire a d'abord été décrite comme une approche centrée sur les fondements des phénomènes biologiques - découvrant les structures des molécules biologiques ainsi que leurs interactions, et comment ces interactions expliquent les observations de la biologie classique.

En 1945, le terme biologie moléculaire a été utilisé par le physicien William Astbury. Le développement dans le domaine de la biologie moléculaire s'est produit très tard pour comprendre que le système complexe ou l'approche avantageuse serait faite de manière simple à comprendre en utilisant des bactéries et des bactériophages, cet organisme fournit des informations sur les processus biologiques de base plus facilement que les cellules animales. En 1953, deux jeunes hommes nommés Francis Crick et James Watson travaillant à l'unité du Medical Research Council, laboratoire Cavendish, Cambridge (maintenant le MRC Laboratory of Molecular Biology ), ont créé un modèle d'ADN à double hélice qui a changé tout le scénario de recherche. ils ont proposé l'ADN structure basée sur des recherches antérieures effectuées par Rosalind Franklin et Maurice Wilkins, puis la recherche a conduit à trouver du matériel ADN dans d'autres micro-organismes, plantes et animaux.

La biologie moléculaire n'est pas simplement l'étude des molécules biologiques et de leurs interactions ; il s'agit plutôt d'un ensemble de techniques développées depuis la genèse du domaine qui ont permis aux scientifiques d'en apprendre davantage sur les processus moléculaires. Une technique notable qui a révolutionné le domaine est la réaction en chaîne par polymérase (PCR), qui a été développée en 1983. La PCR est une réaction qui amplifie de petites quantités d'ADN, et elle est utilisée dans de nombreuses applications dans toutes les disciplines scientifiques, comme nous le verrons plus tard. .

Le dogme central de la biologie moléculaire décrit le processus par lequel l'ADN est transcrit en ARN, qui est ensuite traduit en protéine.

La biologie moléculaire joue également un rôle essentiel dans la compréhension des structures, des fonctions et des contrôles internes au sein des cellules individuelles, qui peuvent toutes être utilisées pour cibler efficacement de nouveaux médicaments, diagnostiquer des maladies et mieux comprendre la physiologie cellulaire. Certaines recherches cliniques et thérapies médicales issues de la biologie moléculaire sont couvertes par la thérapie génique alors que l'utilisation de la biologie moléculaire ou de la biologie cellulaire moléculaire en médecine est désormais appelée médecine moléculaire .

Histoire de la biologie moléculaire

La biologie moléculaire se situe à l'intersection de la biochimie et de la génétique ; Au fur et à mesure de l'émergence et de l'évolution de ces disciplines scientifiques au 20ème siècle, il est devenu clair qu'elles cherchaient toutes deux à déterminer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les fonctions cellulaires vitales. Les progrès de la biologie moléculaire ont été étroitement liés au développement de nouvelles technologies et à leur optimisation. La biologie moléculaire a été élucidée par le travail de nombreux scientifiques, et donc l'histoire du domaine dépend de la compréhension de ces scientifiques et de leurs expériences.

Tout commence par le phénomène de transformation chez la bactérie, en 1928, Frederick Griffith, observe un phénomène de transformation d'une bactérie à l'autre [maintenant connu sous le nom de transformation génétique]. A cette époque, il ne pouvait pas expliquer le phénomène de transformation. Plus tard en 1944, trois scientifiques Oswald Avery, Colin Macleod et Maclyn McCarty, ont démontré tout le phénomène de transformation chez les bactéries. Après, deux ans en 1930, la biologie moléculaire a été établie comme une branche officielle de la science. Mais le terme "biologie moléculaire" n'a été inventé qu'en 1938 et cela a été fait par le scientifique Warren Weaver, qui travaillait comme directeur des sciences naturelles à la Fondation Rockefeller.

De l'expérience suivante, il a été conclu que l'ADN est le matériel génétique de base qui a provoqué les modifications génétiques. La composition de base de l'ADN était connue pour contenir quatre bases appelées - Adénine, Guanine, Thymine et Cytosine. Ainsi, sur les bases de la composition chimique et de la cristallographie aux rayons X, réalisée par Maurice Wilkins et Rosalind Franklin, la structure de l'ADN a été proposée par James Watson et Francis Crick. Mais, avant que Watson et Crick ne proposent la structure de l'ADN, en 1950, le scientifique d'origine autrichienne Erwin Chargaff, a proposé la théorie / règle [aujourd'hui connue sous le nom de règle de Chargaff], qui stipulait que le nombre d'adénine et de thymine et de guanine et de cytosine était égal. proportion.

La règle de Chargaff

"La règle de Chargaff stipulait que l'ADN de n'importe quelle espèce de n'importe quel organisme devrait avoir un rapport stœchiométrique de 1: 1 de purine et de pyrimidines (c'est-à-dire, A + G = T + C) et, plus précisément, que la quantité de guanine devrait être égale à la cytosine et la quantité d'adénine doit être égale à la thymine . Ce schéma se retrouve dans les deux brins de l'ADN".

Le domaine de la génétique est né d'une tentative de comprendre les mécanismes moléculaires de l'héritage génétique et la structure d'un gène . Gregor Mendel a été le pionnier de ce travail en 1866, lorsqu'il a écrit pour la première fois les lois de l'héritage génétique sur la base de ses études sur les croisements d'accouplement dans les plants de pois. Une telle loi de l'héritage génétique est la loi de ségrégation, qui stipule que les individus diploïdes avec deux allèles pour un gène particulier transmettront l'un de ces allèles à leur progéniture. En raison de son travail critique, l'étude de l'héritage génétique est communément appelée génétique mendélienne .

Une étape majeure dans la biologie moléculaire a été la découverte de la structure de l'ADN. Ce travail a commencé en 1869 par Friedrich Miescher, un biochimiste suisse qui a proposé pour la première fois une structure appelée nucléine, que nous savons maintenant être l'acide désoxyribonucléique, ou ADN. Il a découvert cette substance unique en étudiant les composants des bandages remplis de pus et en notant les propriétés uniques des "substances contenant du phosphore". Un autre contributeur notable au modèle de l'ADN était Phoebus Levene, qui a proposé le "modèle polynucléotidique" de l'ADN en 1919 à la suite de ses expériences biochimiques sur la levure. En 1950, Erwin Chargaff a développé les travaux de Levene et a élucidé quelques propriétés critiques des acides nucléiques : premièrement, la séquence des acides nucléiques varie selon les espèces. Deuxièmement, la concentration totale de purines (adénine et guanine) est toujours égale à la concentration totale de pyrimidines (cystéine et thymine). Ceci est maintenant connu sous le nom de règle de Chargaff. En 1953, James Watson et Francis Crick ont ​​publié la structure en double hélice de l'ADN, en utilisant les travaux de cristallographie aux rayons X effectués par Rosalind Franklin et Maurice Wilkins . Watson et Crick ont ​​décrit la structure de l'ADN et ont émis des hypothèses sur les implications de cette structure unique pour les mécanismes possibles de réplication de l'ADN.

JD Watson et FHC Crick ont ​​​​reçu le prix Nobel en 1962, avec Maurice Wilkens, pour avoir proposé un modèle de la structure de l'ADN.

Au fil du temps, en 1964, KA Marker et Frederick Sanger ont découvert un amioacyl-ARNt particulier dans E. coli, appelé N-formyl-méthionyl - ARNt et ont expliqué que cette molécule jouait un rôle dans le mécanisme particulier de l'allongement de la chaîne. Il a reçu le deuxième prix Nobel pour avoir découvert la séquence complète de 5 400 nucléotides d'ADN simple brin de bactériophages F ´ 174.

En 1961, il a été démontré que lorsqu'un gène code pour une protéine, trois bases séquentielles de l' ADN d'un gène spécifient chaque acide aminé successif de la protéine. Ainsi, le code génétique est un code triplet, où chaque triplet (appelé codon) spécifie un acide aminé particulier. De plus, il a été montré que les codons ne se chevauchent pas dans la séquence d'ADN codant pour une protéine, et que chaque séquence est lue à partir d'un point de départ fixe.

De 1962 à 1964, grâce à l'utilisation de mutants létaux conditionnels d'un virus bactérien, des progrès fondamentaux ont été réalisés dans notre compréhension des fonctions et des interactions des protéines employées dans la machinerie de réplication de l'ADN, de réparation de l'ADN, de recombinaison de l'ADN et dans l'assemblage. de structures moléculaires.

Représentation schématique de la structure de l'ADN de Watson et Crick
Description de l'angle dans la structure de l'ADN

L'expérience F.Griffith

Représentation schématique de l'expérience

En 1928, Fredrick Griffith a découvert une propriété de virulence chez les bactéries pneumocoques, qui tuait des rats de laboratoire. Selon Mendel, répandu à cette époque, le transfert de gènes ne pouvait se produire que des cellules mères aux cellules filles. Griffith a avancé une autre théorie, déclarant que le transfert de gènes se produisant chez les membres de la même génération est connu sous le nom de transfert horizontal de gènes (HGT). Ce phénomène est maintenant appelé transformation génétique.

Griffith a abordé la bactérie Streptococcus pneumoniae, qui avait deux souches différentes, une virulente et lisse et une avirulente et rugueuse. La souche lisse avait un aspect scintillant en raison de la présence d'un type de polysaccharide spécifique - un polymère de capsule de glucose et d'acide glucuronique. En raison de cette couche polysaccharidique de bactéries, le système immunitaire d'un hôte ne peut pas reconnaître les bactéries et tue l'hôte. L'autre souche, avirulente et rugueuse, est dépourvue de cette capsule polysaccharidique et a un aspect terne et rugueux.

La présence ou l'absence de capsule dans la souche est connue pour être génétiquement déterminée. Les déformations lisses et rugueuses se produisent dans plusieurs types différents tels que SI, S-II, S-III, etc. et RI, R-II, R-III, etc. respectivement. Tous ces sous-types de bactéries S et R diffèrent les uns des autres par le type d'antigène qu'ils produisent.

Expérience de Hershey et Chase

Expérience de Hershey et Chase

La confirmation que l'ADN est le matériel génétique qui est la cause de l'infection est venue de l'expérience de Hershey et Chase. Ils ont utilisé E. coli et un bactériophage pour l'expérience. Cette expérience est également connue sous le nom d'expérience de mélangeur, car le mélangeur de cuisine a été utilisé comme un appareil majeur. Alfred Hershey et Martha Chase ont démontré que l'ADN injecté par une particule de phage dans une bactérie contient toutes les informations nécessaires pour synthétiser les particules de phage descendant. Ils ont utilisé la radioactivité pour étiqueter l'enveloppe protéique du bactériophage avec du soufre radioactif et de l'ADN avec du phosphore radioactif, respectivement dans deux tubes à essai différents. Après avoir mélangé le bactériophage et E. coli dans le tube à essai, la période d'incubation commence au cours de laquelle le phage transforme le matériel génétique dans les cellules E. coli . Ensuite, le mélange est mélangé ou agité, ce qui sépare le phage des cellules E. coli . L'ensemble du mélange est centrifugé et le culot qui contient les cellules E. coli a été contrôlé et le surnageant a été jeté. Les cellules d'E. coli présentaient du phosphore radioactif, ce qui indiquait que le matériau transformé était de l'ADN et non l'enveloppe protéique.

L'ADN transformé s'attache à l'ADN d' E. coli et la radioactivité n'est visible que sur l'ADN du bactériophage. Cet ADN muté peut être transmis à la génération suivante et la théorie de la transduction est née. La transduction est un processus dans lequel l'ADN bactérien transporte le fragment de bactériophages et le transmet à la génération suivante. Il s'agit également d'un type de transfert horizontal de gènes.

Biologie moléculaire moderne

A l'approche du milieu des années 20, la biologie moléculaire entre dans un âge d'or défini par un développement technique à la fois vertical et horizontal. Verticalement, de nouvelles technologies permettent une surveillance en temps réel des processus biologiques au niveau atomique. Les biologistes moléculaires ont aujourd'hui accès à des données de séquençage de plus en plus abordables à des profondeurs de plus en plus élevées, facilitant le développement de nouvelles méthodes de manipulation génétique dans de nouveaux organismes non modèles. De même, les biologistes moléculaires synthétiques piloteront la production industrielle de petites et macromolécules grâce à l'introduction de voies métaboliques exogènes dans diverses lignées cellulaires procaryotes et eucaryotes.

Horizontalement, les données de séquençage deviennent plus abordables et utilisées dans de nombreux domaines scientifiques différents. Cela stimulera le développement des industries dans les pays en développement et augmentera l'accessibilité aux chercheurs individuels. De même, les expériences d'édition de gènes CRISPR-Cas9 peuvent désormais être conçues et mises en œuvre par des particuliers pour moins de 10 000 $ dans de nouveaux organismes, ce qui stimulera le développement d'applications industrielles et médicales.

Relation avec d'autres sciences biologiques

Relation schématique entre biochimie, génétique et biologie moléculaire

La liste suivante décrit un point de vue sur les relations interdisciplinaires entre la biologie moléculaire et d'autres domaines connexes.

Alors que les chercheurs pratiquent des techniques propres à la biologie moléculaire, il est courant de les combiner avec des méthodes issues de la génétique et de la biochimie . Une grande partie de la biologie moléculaire est quantitative et, récemment, une quantité importante de travaux a été effectuée à l'aide de techniques informatiques telles que la bioinformatique et la biologie computationnelle . La génétique moléculaire, l'étude de la structure et de la fonction des gènes, fait partie des sous-domaines les plus importants de la biologie moléculaire depuis le début des années 2000. D'autres branches de la biologie sont informées par la biologie moléculaire, soit en étudiant directement les interactions des molécules à part entière, comme dans la biologie cellulaire et la biologie du développement, soit indirectement, où les techniques moléculaires sont utilisées pour déduire les attributs historiques des populations ou des espèces, comme dans domaines de la biologie évolutive tels que la génétique des populations et la phylogénétique . Il existe également une longue tradition d'étude des biomolécules "à partir de zéro", ou moléculairement, en biophysique .

Techniques de biologie moléculaire

Animation ADN

Clonage moléculaire

Image de transduction

Le clonage moléculaire est utilisé pour isoler puis transférer une séquence d'ADN d'intérêt dans un vecteur plasmidique. Cette technologie de l'ADN recombinant a été développée pour la première fois dans les années 1960. Dans cette technique, une séquence d' ADN codant pour une protéine d'intérêt est clonée à l' aide d' une réaction en chaîne par polymérase (PCR), et/ou d' enzymes de restriction, dans un plasmide ( vecteur d'expression ). Le vecteur plasmidique a généralement au moins 3 caractéristiques distinctives : une origine de réplication, un site de clonage multiple (MCS) et un marqueur sélectif (généralement une résistance aux antibiotiques ). De plus, en amont du MCS se trouvent les régions promotrices et le site de démarrage de la transcription, qui régulent l'expression du gène cloné.

Ce plasmide peut être inséré dans des cellules bactériennes ou animales. L'introduction d'ADN dans des cellules bactériennes peut se faire par transformation via l'absorption d'ADN nu, la conjugaison via un contact cellule-cellule ou par transduction via un vecteur viral. L'introduction d'ADN dans des cellules eucaryotes, telles que des cellules animales, par des moyens physiques ou chimiques est appelée transfection . Plusieurs techniques de transfection différentes sont disponibles, telles que la transfection au phosphate de calcium, l' électroporation, la microinjection et la transfection par liposomes . Le plasmide peut être intégré dans le génome, entraînant une transfection stable, ou peut rester indépendant du génome et exprimé temporairement, ce que l'on appelle une transfection transitoire.

L'ADN codant pour une protéine d'intérêt se trouve maintenant à l'intérieur d'une cellule, et la protéine peut maintenant être exprimée. Une variété de systèmes, tels que des promoteurs inductibles et des facteurs de signalisation cellulaire spécifiques, sont disponibles pour aider à exprimer la protéine d'intérêt à des niveaux élevés. De grandes quantités d'une protéine peuvent alors être extraites de la cellule bactérienne ou eucaryote. La protéine peut être testée pour son activité enzymatique dans diverses situations, la protéine peut être cristallisée afin que sa structure tertiaire puisse être étudiée ou, dans l'industrie pharmaceutique, l'activité de nouveaux médicaments contre la protéine peut être étudiée.

Réaction en chaîne par polymérase

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique extrêmement polyvalente pour copier l'ADN. En bref, la PCR permet de copier ou de modifier une séquence d'ADN spécifique de manière prédéterminée. La réaction est extrêmement puissante et, dans des conditions parfaites, pourrait amplifier une molécule d'ADN pour devenir 1,07 milliard de molécules en moins de deux heures. La PCR a de nombreuses applications, notamment l'étude de l'expression génique, la détection de micro-organismes pathogènes, la détection de mutations génétiques et l'introduction de mutations dans l'ADN. La technique de PCR peut être utilisée pour introduire des sites d'enzymes de restriction aux extrémités de molécules d'ADN, ou pour faire muter des bases particulières d'ADN, cette dernière est une méthode appelée mutagenèse dirigée . La PCR peut également être utilisée pour déterminer si un fragment d'ADN particulier se trouve dans une banque d' ADNc . La PCR a de nombreuses variantes, comme la PCR de transcription inverse ( RT-PCR ) pour l'amplification de l'ARN et, plus récemment, la PCR quantitative qui permet une mesure quantitative des molécules d'ADN ou d'ARN.

Gel d' agarose à deux pour cent dans un tampon borate coulé dans un plateau de gel.

Électrophorèse sur gel

FDS-PAGE

L'électrophorèse sur gel est une technique qui sépare les molécules par leur taille à l'aide d'un gel d'agarose ou de polyacrylamide. Cette technique est l'un des principaux outils de la biologie moléculaire. Le principe de base est que les fragments d'ADN peuvent être séparés en appliquant un courant électrique à travers le gel - parce que le squelette de l'ADN contient des groupes phosphate chargés négativement, l'ADN migrera à travers le gel d'agarose vers l'extrémité positive du courant. Les protéines peuvent également être séparées sur la base de la taille à l'aide d'un gel SDS-PAGE, ou sur la base de la taille et de leur charge électrique en utilisant ce que l'on appelle une électrophorèse sur gel 2D .

Protéines colorées sur un gel PAGE à l'aide d'un colorant bleu de Coomassie.

Le test de Bradford

Le Bradford Assay est une technique de biologie moléculaire qui permet la quantification rapide et précise des molécules de protéines en utilisant les propriétés uniques d'un colorant appelé Coomassie Brilliant Blue G-250. Le bleu de Coomassie subit un changement de couleur visible du brun rougeâtre au bleu vif lors de la liaison aux protéines. Dans son état cationique instable, le bleu de Coomassie a une longueur d'onde de fond de 465 nm et dégage une couleur brun rougeâtre. Lorsque le bleu de Coomassie se lie à une protéine dans une solution acide, la longueur d'onde de fond passe à 595 nm et le colorant dégage une couleur bleu vif. Les protéines du test se lient au bleu de Coomassie en environ 2 minutes et le complexe protéine-colorant est stable pendant environ une heure, bien qu'il soit recommandé que les lectures d'absorbance soient prises dans les 5 à 20 minutes suivant le début de la réaction. La concentration de protéines dans le test de Bradford peut ensuite être mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à lumière visible et ne nécessite donc pas d'équipement important.

Cette méthode a été développée en 1975 par Marion M. Bradford et a permis une quantification des protéines beaucoup plus rapide et plus précise par rapport aux méthodes précédentes : la procédure de Lowry et le dosage du biuret. Contrairement aux méthodes précédentes, le test de Bradford n'est pas sensible aux interférences de plusieurs molécules non protéiques, notamment l'éthanol, le chlorure de sodium et le chlorure de magnésium. Cependant, il est susceptible d'être influencé par des agents tampons alcalins puissants, tels que le dodécylsulfate de sodium (SDS).

Transfert et sondage de macromolécules

Les termes Northern, Western et Eastern blot sont dérivés de ce qui était initialement une blague de biologie moléculaire qui jouait sur le terme Southern blotting, d'après la technique décrite par Edwin Southern pour l'hybridation de l'ADN buvardé. Patricia Thomas, développeur du transfert d'ARN qui est ensuite devenu connu sous le nom de Northern blot, n'a en fait pas utilisé le terme.

Southern Blot

Nommé d'après son inventeur, le biologiste Edwin Southern, le Southern blot est une méthode pour sonder la présence d'une séquence d'ADN spécifique dans un échantillon d'ADN. Les échantillons d'ADN avant ou après digestion par une enzyme de restriction (endonucléase de restriction) sont séparés par électrophorèse sur gel puis transférés sur une membrane par transfert par capillarité . La membrane est ensuite exposée à une sonde d'ADN marquée qui a une séquence de bases complémentaire à la séquence sur l'ADN d'intérêt. Le transfert de Southern est moins couramment utilisé en science de laboratoire en raison de la capacité d'autres techniques, telles que la PCR, à détecter des séquences d'ADN spécifiques à partir d'échantillons d'ADN. Cependant, ces transferts sont encore utilisés pour certaines applications, telles que la mesure du nombre de copies de transgènes chez des souris transgéniques ou dans l'ingénierie de lignées de cellules souches embryonnaires knock -out .

Northern blot

Diagramme Northern blot

Le Northern blot est utilisé pour étudier la présence de molécules d'ARN spécifiques en tant que comparaison relative entre un ensemble d'échantillons différents d'ARN. Il s'agit essentiellement d'une combinaison d' électrophorèse sur gel d'ARN dénaturant et d'un transfert . Dans ce processus, l'ARN est séparé en fonction de la taille et est ensuite transféré sur une membrane qui est ensuite sondée avec un complément marqué d'une séquence d'intérêt. Les résultats peuvent être visualisés de différentes manières en fonction de l'étiquette utilisée ; cependant, la plupart aboutissent à la révélation de bandes représentant les tailles de l'ARN détecté dans l'échantillon. L'intensité de ces bandes est liée à la quantité d'ARN cible dans les échantillons analysés. La procédure est couramment utilisée pour étudier quand et combien d'expression génique se produit en mesurant la quantité de cet ARN présente dans différents échantillons, en supposant qu'aucune régulation post-transcriptionnelle ne se produit et que les niveaux d'ARNm reflètent des niveaux proportionnels de la protéine correspondante étant produit. C'est l'un des outils les plus élémentaires pour déterminer à quel moment et dans quelles conditions certains gènes sont exprimés dans les tissus vivants.

Western blot

Un western blot est une technique par laquelle des protéines spécifiques peuvent être détectées à partir d'un mélange de protéines. Les transferts Western peuvent être utilisés pour déterminer la taille des protéines isolées, ainsi que pour quantifier leur expression. Dans le Western Blot, les protéines sont d'abord séparées par taille, dans un gel mince pris en sandwich entre deux plaques de verre dans une technique connue sous le nom de SDS-PAGE . Les protéines du gel sont ensuite transférées sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF), de nitrocellulose, de nylon ou autre support. Cette membrane peut ensuite être sondée avec des solutions d' anticorps . Les anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine d'intérêt peuvent ensuite être visualisés par diverses techniques, notamment les produits colorés, la chimiluminescence ou l' autoradiographie . Souvent, les anticorps sont marqués avec des enzymes. Lorsqu'un substrat chimioluminescent est exposé à l' enzyme, il permet la détection. L'utilisation des techniques de Western Blot permet non seulement la détection mais aussi l'analyse quantitative. Des méthodes analogues au transfert Western peuvent être utilisées pour colorer directement des protéines spécifiques dans des cellules vivantes ou des coupes de tissus .

Transfert oriental

La technique de transfert oriental est utilisée pour détecter la modification post-traductionnelle des protéines. Les protéines transférées sur la membrane de PVDF ou de nitrocellulose sont sondées pour des modifications à l'aide de substrats spécifiques.

Microréseaux

Une puce à ADN en cours d'impression
Hybridation de la cible à la sonde

Une micropuce à ADN est une collection de spots attachés à un support solide tel qu'une lame de microscope où chaque spot contient un ou plusieurs fragments d' oligonucléotides d'ADN simple brin . Les matrices permettent de déposer de grandes quantités de très petits spots (100 micromètres de diamètre) sur une seule lame. Chaque spot a une molécule de fragment d'ADN qui est complémentaire d'une seule séquence d'ADN . Une variante de cette technique permet de qualifier l'expression génique d'un organisme à un stade particulier de son développement ( profilage d'expression ). Dans cette technique, l'ARN d'un tissu est isolé et converti en ADN complémentaire marqué (ADNc). Cet ADNc est ensuite hybridé aux fragments sur le réseau et la visualisation de l'hybridation peut être effectuée. Étant donné que plusieurs matrices peuvent être réalisées avec exactement la même position de fragments, elles sont particulièrement utiles pour comparer l'expression génique de deux tissus différents, tels qu'un tissu sain et cancéreux. En outre, on peut mesurer quels gènes sont exprimés et comment cette expression change avec le temps ou avec d'autres facteurs. Il existe de nombreuses façons de fabriquer des puces à ADN; les plus courants sont les puces de silicium, les lames de microscope avec des taches d'environ 100 micromètres de diamètre, les matrices personnalisées et les matrices avec des taches plus grandes sur des membranes poreuses (macroarrays). Il peut y avoir de 100 spots à plus de 10 000 sur un tableau donné. Les matrices peuvent également être constituées de molécules autres que l'ADN.

Oligonucléotide spécifique d'allèle

L'oligonucléotide spécifique d'allèle (ASO) est une technique qui permet la détection de mutations d'une seule base sans nécessiter de PCR ou d'électrophorèse sur gel. Des sondes courtes (20 à 25 nucléotides de longueur) marquées sont exposées à l'ADN cible non fragmenté, l'hybridation se produit avec une spécificité élevée en raison de la courte longueur des sondes et même un seul changement de base entravera l'hybridation. L'ADN cible est ensuite lavé et les sondes marquées qui ne se sont pas hybridées sont éliminées. L'ADN cible est ensuite analysé pour la présence de la sonde par radioactivité ou fluorescence. Dans cette expérience, comme dans la plupart des techniques de biologie moléculaire, un contrôle doit être utilisé pour assurer une expérimentation réussie.

En biologie moléculaire, les procédures et les technologies sont continuellement développées et les technologies plus anciennes abandonnées. Par exemple, avant l'avènement de l' électrophorèse sur gel d'ADN ( agarose ou polyacrylamide ), la taille des molécules d'ADN était généralement déterminée par la vitesse de sédimentation dans des gradients de saccharose, une technique lente et laborieuse nécessitant une instrumentation coûteuse ; avant les gradients de saccharose, la viscosimétrie a été utilisée. Outre leur intérêt historique, il est souvent utile de connaître les technologies plus anciennes, car elles sont parfois utiles pour résoudre un autre problème nouveau pour lequel la technique la plus récente est inappropriée.

Voir également

Références

Lectures complémentaires

Liens externes