Moleculaire biologie -Molecular biology

Van Wikipedia, de gratis encyclopedie

Moleculaire biologie / m ə ˈ l ɛ k j ʊ l ər / is de tak van de biologie die probeert de moleculaire basis van biologische activiteit in en tussen cellen te begrijpen, inclusief moleculaire synthese, modificatie, mechanismen en interacties. De studie van de chemische en fysische structuur van biologische macromoleculen staat bekend als moleculaire biologie.

Moleculaire biologie werd voor het eerst beschreven als een benadering die gericht was op de onderbouwing van biologische fenomenen - het blootleggen van de structuren van biologische moleculen en hun interacties, en hoe deze interacties observaties van de klassieke biologie verklaren.

In 1945 werd de term moleculaire biologie gebruikt door natuurkundige William Astbury. De ontwikkeling op het gebied van moleculaire biologie gebeurde erg laat om te begrijpen dat het complexe systeem of de voordelige benadering op een eenvoudige manier zou worden gemaakt door bacteriën en bacteriofagen te gebruiken. Dit organisme geeft gemakkelijker informatie over het fundamentele biologische proces dan dierlijke cellen. In 1953 maakten toen twee jonge mannen, Francis Crick en James Watson, werkzaam bij de Medical Research Council-eenheid, Cavendish-laboratorium, Cambridge (nu het MRC Laboratory of Molecular Biology ), een dubbel helixmodel van DNA dat het hele onderzoeksscenario veranderde. structuur gebaseerd op eerder onderzoek van Rosalind Franklin en Maurice Wilkins, waarna het onderzoek leidde tot het vinden van DNA-materiaal in andere micro-organismen, planten en dieren.

Moleculaire biologie is niet alleen de studie van biologische moleculen en hun interacties; het is eerder ook een verzameling technieken die sinds het ontstaan ​​van het veld zijn ontwikkeld en die wetenschappers in staat hebben gesteld om meer te weten te komen over moleculaire processen. Een opmerkelijke techniek die een revolutie teweeg heeft gebracht in het veld, is de polymerasekettingreactie (PCR), die in 1983 werd ontwikkeld. PCR is een reactie die kleine hoeveelheden DNA amplificeert en wordt in veel toepassingen in wetenschappelijke disciplines gebruikt, zoals later zal worden besproken. .

Het centrale dogma van de moleculaire biologie beschrijft het proces waarbij DNA wordt getranscribeerd in RNA, dat vervolgens wordt vertaald in eiwit.

Moleculaire biologie speelt ook een cruciale rol bij het begrijpen van structuren, functies en interne controles binnen individuele cellen, die allemaal kunnen worden gebruikt om nieuwe medicijnen efficiënt aan te pakken, ziekten te diagnosticeren en celfysiologie beter te begrijpen. Sommige klinische onderzoeken en medische therapieën die voortkomen uit de moleculaire biologie vallen onder gentherapie, terwijl het gebruik van moleculaire biologie of moleculaire celbiologie in de geneeskunde nu moleculaire geneeskunde wordt genoemd .

Geschiedenis van de moleculaire biologie

Moleculaire biologie bevindt zich op het snijvlak van biochemie en genetica; toen deze wetenschappelijke disciplines ontstonden en zich ontwikkelden in de 20e eeuw, werd het duidelijk dat ze allebei probeerden de moleculaire mechanismen te bepalen die ten grondslag liggen aan vitale cellulaire functies. Vooruitgang in de moleculaire biologie is nauw verbonden met de ontwikkeling van nieuwe technologieën en hun optimalisatie. Moleculaire biologie is opgehelderd door het werk van veel wetenschappers, en dus hangt de geschiedenis van het veld af van een goed begrip van deze wetenschappers en hun experimenten.

Het begint allemaal met het fenomeen van transformatie in de bacteriën, in 1928 observeerde Frederick Griffith een fenomeen van transformatie van de ene bacterie naar de andere [nu bekend als genetische transformatie]. Op dat moment kon hij het fenomeen transformatie niet verklaren. Later in 1944 demonstreerden drie wetenschappers Oswald Avery, Colin Macleod en Maclyn McCarty het hele fenomeen van transformatie in de bacteriën. Na, twee jaar in 1930, werd de moleculaire biologie opgericht als een officiële tak van wetenschap. Maar de term 'Moleculaire Biologie' werd pas in 1938 bedacht en dat werd gedaan door de wetenschapper Warren Weaver, die werkte als directeur Natuurwetenschappen bij de Rockefeller Foundation.

Uit het volgende experiment werd geconcludeerd dat DNA het genetische basismateriaal is dat de genetische veranderingen veroorzaakte. Van de basissamenstelling van het DNA was bekend dat het vier basen bevat die bekend staan ​​als - Adenine, Guanine, Thymine en Cytosine. Dus, op basis van de chemische samenstelling en de röntgenkristallografie, gedaan door Maurice Wilkins en Rosalind Franklin, werd de DNA-structuur voorgesteld door James Watson en Francis Crick. Maar voordat Watson en Crick de DNA-structuur voorstelden, stelde de in Oostenrijk geboren wetenschapper Erwin Chargaff in 1950 de theorie / regel [vandaag bekend als de regel van Chargaff] voor, die stelde dat het aantal Adenine en Thymine en Guanine en Cytosine gelijk is aan proportie.

De regel van de Chargaff

"De regel van Chargaff stelde dat DNA van elke soort van elk organisme een stoichiometrische verhouding van 1: 1 van purine en pyrimidines (dwz A + G = T + C) zou moeten hebben en, meer specifiek, dat de hoeveelheid guanine gelijk zou moeten zijn aan cytosine en de hoeveelheid adenine moet gelijk zijn aan thymine . Dit patroon wordt gevonden in beide strengen van het DNA".

Het gebied van de genetica ontstond als een poging om de moleculaire mechanismen van genetische overerving en de structuur van een gen te begrijpen . Gregor Mendel was een pionier in dit werk in 1866, toen hij voor het eerst de wetten van genetische overerving schreef op basis van zijn studies van paringskruisen in erwtenplanten. Een dergelijke wet van genetische overerving is de wet van segregatie, die stelt dat diploïde individuen met twee allelen voor een bepaald gen een van deze allelen zullen doorgeven aan hun nakomelingen. Vanwege zijn kritische werk wordt de studie van genetische overerving gewoonlijk Mendeliaanse genetica genoemd .

Een belangrijke mijlpaal in de moleculaire biologie was de ontdekking van de structuur van DNA. Dit werk begon in 1869 door Friedrich Miescher, een Zwitserse biochemicus die voor het eerst een structuur voorstelde genaamd nucleïne, waarvan we nu weten dat het deoxyribonucleïnezuur of DNA is. Hij ontdekte deze unieke stof door de componenten van met pus gevulde verbanden te bestuderen en de unieke eigenschappen van de "fosforhoudende stoffen" op te merken. Een andere opmerkelijke bijdrage aan het DNA-model was Phoebus Levene, die in 1919 het "polynucleotidemodel" van DNA voorstelde als resultaat van zijn biochemische experimenten met gist. In 1950 breidde Erwin Chargaff het werk van Levene uit en lichtte een paar kritische eigenschappen van nucleïnezuren toe: ten eerste varieert de sequentie van nucleïnezuren tussen soorten. Ten tweede is de totale concentratie van purines (adenine en guanine) altijd gelijk aan de totale concentratie van pyrimidinen (cysteïne en thymine). Dit staat nu bekend als de regel van Chargaff. In 1953 publiceerden James Watson en Francis Crick de dubbele helixstructuur van DNA, met behulp van het röntgenkristallografiewerk van Rosalind Franklin en Maurice Wilkins . Watson en Crick beschreven de structuur van DNA en gissingen over de implicaties van deze unieke structuur voor mogelijke mechanismen van DNA-replicatie.

JD Watson en FHC Crick kregen in 1962 samen met Maurice Wilkens de Nobelpr voor het voorstellen van een model van de structuur van DNA.

Na verloop van tijd ontdekten KA Marcker en Frederick Sanger in 1964 een eigenaardig amioacyl-tRNA in E.coli, N-formylmethionyl-tRNA genaamd, en legden uit dat dit molecuul een rol speelt in een speciaal mechanisme van de ketenverlenging. Hij kreeg de tweede Nobelpr voor het ontdekken van de volledige sequentie van 5.400 nucleotiden van enkelstrengs DNA van F' 174 bacteriofagen.

In 1961 werd aangetoond dat wanneer een gen codeert voor een eiwit, drie opeenvolgende basen van het DNA van een gen elk opeenvolgend aminozuur van het eiwit specificeren. De genetische code is dus een tripletcode, waarbij elk triplet (een codon genoemd) een bepaald aminozuur specificeert. Verder werd aangetoond dat de codons elkaar niet overlappen in de DNA-sequentie die codeert voor een eiwit, en dat elke sequentie wordt afgelezen vanaf een vast startpunt.

Tijdens 1962-1964 werden door het gebruik van voorwaardelijke dodelijke mutanten van een bacterieel virus fundamentele vooruitgang geboekt in ons begrip van de functies en interacties van de eiwitten die worden gebruikt in de machinerie van DNA-replicatie, DNA-reparatie, DNA-recombinatie en in de assemblage van moleculaire structuren.

Schematische weergave van de DNA-structuur van Watson en Crick
Hoekbeschrijving in DNA-structuur

Het F.Griffith-experiment

Schematische weergave van experiment

In 1928 ontmoette Fredrick Griffith een virulentie-eigenschap in pneumokokkenbacteriën, die laboratoriumratten doodden. Volgens Mendel, dat destijds gangbaar was, kon genoverdracht alleen plaatsvinden van ouder- naar dochtercellen. Griffith bracht een andere theorie naar voren, waarin staat dat genoverdracht die optreedt bij leden van dezelfde generatie bekend staat als horizontale genoverdracht (HGT). Dit fenomeen wordt nu genetische transformatie genoemd.

Griffith richtte zich op de Streptococcus pneumoniae- bacterie, die twee verschillende stammen had, een virulente en gladde en een avirulente en ruwe. De gladde stam had een glinsterend uiterlijk dankzij de aanwezigheid van een type specifiek polysacharide - een polymeer van glucose en glucuronzuurcapsule. Door deze polysaccharidelaag van bacteriën kan het immuunsysteem van een gastheer de bacteriën niet herkennen en doodt het de gastheer. De andere, avirulente, ruwe soort mist deze polysacharide capsule en heeft een dof, ruw uiterlijk.

Het is bekend dat de aanwezigheid of afwezigheid van een capsule in de stam genetisch bepaald is. Gladde en ruwe stammen komen voor in verschillende soorten, zoals respectievelijk SI, S-II, S-III, enz. en RI, R-II, R-III, enz.. Al deze subtypes van S- en R-bacteriën verschillen van elkaar in het antigeentype dat ze produceren.

Hershey en Chase-experiment

Hershey en Chase-experiment

Bevestiging dat DNA het genetische materiaal is dat de oorzaak van infectie is, kwam van het Hershey en Chase-experiment. Ze gebruikten E.coli en bacteriofaag voor het experiment. Dit experiment staat ook bekend als blender-experiment, omdat keukenblender als een belangrijk apparaat werd gebruikt. Alfred Hershey en Martha Chase toonden aan dat het DNA dat door een faagdeeltje in een bacterie wordt geïnjecteerd, alle informatie bevat die nodig is om nageslacht-faagdeeltjes te synthetiseren. Ze gebruikten radioactiviteit om de eiwitmantel van de bacteriofaag te labelen met radioactief zwavel en DNA met radioactief fosfor, respectievelijk in twee verschillende reageerbuizen. Na het mengen van bacteriofaag en E.coli in de reageerbuis begint de incubatieperiode waarin faag het genetische materiaal in de E.coli - cellen transformeert. Vervolgens wordt het mengsel gemengd of geschud, waardoor de faag wordt gescheiden van E.coli- cellen. Het hele mengsel wordt gecentrifugeerd en de pellet die E.coli- cellen bevat, werd gecontroleerd en het supernatant werd weggegooid. De E.coli -cellen vertoonden radioactief fosfor, wat aangaf dat het getransformeerde materiaal DNA was en niet de eiwitmantel.

Het getransformeerde DNA wordt gehecht aan het DNA van E.coli en radioactiviteit wordt alleen gezien op het DNA van de bacteriofaag. Dit gemuteerde DNA kan worden doorgegeven aan de volgende generatie en de theorie van Transductie is ontstaan. Transductie is een proces waarbij het bacteriële DNA het fragment van bacteriofagen draagt ​​en doorgeeft aan de volgende generatie. Dit is ook een vorm van horizontale genoverdracht.

Moderne moleculaire biologie

Nu we het midden van de jaren 20 naderen, gaat de moleculaire biologie een gouden tijdperk in dat wordt bepaald door zowel verticale als horizontale technische ontwikkeling. Verticaal maken nieuwe technologieën realtime monitoring van biologische processen op atomair niveau mogelijk. Moleculair biologen hebben tegenwoordig toegang tot steeds betaalbare sequentiegegevens op steeds grotere diepten, wat de ontwikkeling van nieuwe genetische manipulatiemethoden in nieuwe niet-modelorganismen mogelijk maakt. Evenzo zullen synthetische moleculair biologen de industriële productie van kleine en macromoleculen stimuleren door de introductie van exogene metabole routes in verschillende prokaryotische en eukaryote cellijnen.

Horizontaal worden sequentiegegevens steeds betaalbaarder en worden ze op veel verschillende wetenschappelijke gebieden gebruikt. Dit zal de ontwikkeling van industrieën in ontwikkelingslanden stimuleren en de toegankelijkheid voor individuele onderzoekers vergroten. Evenzo kunnen CRISPR-Cas9-experimenten voor het bewerken van genen nu door individuen worden bedacht en geïmplementeerd voor minder dan $ 10.000 in nieuwe organismen, wat de ontwikkeling van industriële en medische toepassingen zal stimuleren

Relatie met andere biologische wetenschappen

Schematische relatie tussen biochemie, genetica en moleculaire biologie

De volgende lt beschrijft een standpunt over de interdisciplinaire relaties tussen moleculaire biologie en andere verwante gebieden.

Terwijl onderzoekers technieken toepassen die specifiek zijn voor de moleculaire biologie, is het gebruikelijk om deze te combineren met methoden uit de genetica en biochemie . Veel van de moleculaire biologie is kwantitatief, en recentelijk is er een aanzienlijke hoeveelheid werk verricht met behulp van computerwetenschappelijke technieken zoals bio-informatica en computationele biologie . Moleculaire genetica, de studie van de structuur en functie van genen, behoort sinds het begin van de jaren 2000 tot de meest prominente deelgebieden van de moleculaire biologie. Andere takken van de biologie worden geïnformeerd door de moleculaire biologie, door ofwel direct de interacties van moleculen op zich te bestuderen, zoals in celbiologie en ontwikkelingsbiologie, ofwel indirect, waarbij moleculaire technieken worden gebruikt om historische kenmerken van populaties of soorten af ​​te leiden, zoals in velden in de evolutionaire biologie zoals populatiegenetica en fylogenetica . Er is ook een lange traditie van het bestuderen van biomoleculen "van de grond af", of moleculair, in de biofysica .

Technieken van moleculaire biologie

DNA-animatie

Moleculair klonen

Transductie afbeelding

Moleculair klonen wordt gebruikt om een ​​van belang zijnde DNA-sequentie te isoleren en vervolgens over te brengen naar een plasmidevector. Deze recombinant-DNA-technologie werd voor het eerst ontwikkeld in de jaren zestig. Bij deze techniek wordt een DNA -sequentie die codeert voor een van belang zijnd eiwit gekloneerd met behulp van polymerasekettingreactie (PCR) en/of restrictie-enzymen in een plasmide ( expressievector ). De plasmidevector heeft meestal ten minste 3 onderscheidende kenmerken: een oorsprong van replicatie, een meervoudige kloneringsplaats (MCS) en een selectieve marker (meestal antibioticaresistentie ). Bovendien zijn stroomopwaarts van de MCS de promotorregio's en de transcriptiestartplaats, die de expressie van het gekloonde gen reguleren.

Dit plasmide kan worden ingebracht in bacteriële of dierlijke cellen. Het introduceren van DNA in bacteriële cellen kan gebeuren door transformatie via opname van naakt DNA, conjugatie via cel-celcontact of door transductie via virale vector. Het introduceren van DNA in eukaryote cellen, zoals dierlijke cellen, door fysieke of chemische middelen wordt transfectie genoemd . Er zijn verschillende transfectietechnieken beschikbaar, zoals calciumfosfaattransfectie, elektroporatie, micro -injectie en liposoomtransfectie . Het plasmide kan in het genoom worden geïntegreerd, wat resulteert in een stabiele transfectie, of kan onafhankelijk van het genoom blijven en tijdelijk tot expressie worden gebracht, een zogenaamde transiënte transfectie.

DNA dat codeert voor een eiwit van belang bevindt zich nu in een cel en het eiwit kan nu tot expressie worden gebracht. Een verscheidenheid aan systemen, zoals induceerbare promotors en specifieke celsignaleringsfactoren, zijn beschikbaar om het eiwit van belang op hoge niveaus tot expressie te brengen. Grote hoeveelheden eiwit kunnen dan uit de bacteriële of eukaryote cel worden geëxtraheerd. Het eiwit kan in verschillende situaties worden getest op enzymatische activiteit, het eiwit kan worden gekristalliseerd zodat de tertiaire structuur ervan kan worden bestudeerd, of in de farmaceutische industrie kan de activiteit van nieuwe geneesmiddelen tegen het eiwit worden bestudeerd.

Polymerasekettingreactie

Polymerasekettingreactie (PCR) is een uiterst veelzijdige techniek voor het kopiëren van DNA. Kortom, met PCR kan een specifieke DNA-sequentie op vooraf bepaalde manieren worden gekopieerd of gewijzigd. De reactie is extreem krachtig en zou onder perfecte omstandigheden één DNA-molecuul kunnen versterken tot 1,07 miljard moleculen in minder dan twee uur. PCR heeft vele toepassingen, waaronder de studie van genexpressie, de detectie van pathogene micro-organismen, de detectie van genetische mutaties en de introductie van mutaties in DNA. De PCR-techniek kan worden gebruikt om restrictie-enzymplaatsen aan uiteinden van DNA-moleculen te introduceren, of om bepaalde DNA-basen te muteren, de laatste is een methode die wordt aangeduid als plaatsgerichte mutagenese . PCR kan ook worden gebruikt om te bepalen of een bepaald DNA-fragment in een cDNA-bibliotheek wordt gevonden . PCR kent vele variaties, zoals reverse transcriptie PCR ( RT-PCR ) voor amplificatie van RNA, en, meer recentelijk, kwantitatieve PCR die kwantitatieve meting van DNA- of RNA-moleculen mogelijk maakt.

Twee procent agarosegel in boraatbuffer gegoten in een geltray.

Gelelektroforese

SDS-PAGINA

Gelelektroforese is een techniek die moleculen scheidt op grootte met behulp van een agarose- of polyacrylamidegel. Deze techniek is een van de belangrijkste instrumenten van de moleculaire biologie. Het basisprincipe is dat DNA-fragmenten kunnen worden gescheiden door een elektrische stroom over de gel aan te leggen - omdat de DNA-ruggengraat negatief geladen fosfaatgroepen bevat, zal het DNA door de agarosegel migreren naar het positieve uiteinde van de stroom. Eiwitten kunnen ook worden gescheiden op basis van grootte met behulp van een SDS-PAGE- gel, of op basis van grootte en hun elektrische lading met behulp van wat bekend staat als een 2D-gelelektroforese .

Eiwitten gekleurd op een PAGE-gel met behulp van Coomassie-blauwe kleurstof.

De Bradford-assay

De Bradford-assay is een moleculair-biologische techniek die de snelle, nauwkeurige kwantificering van eiwitmoleculen mogelijk maakt met behulp van de unieke eigenschappen van een kleurstof genaamd Coomassie Brilliant Blue G-250. Coomassie Blue ondergaat een zichtbare kleurverschuiving van roodbruin naar helderblauw bij binding aan eiwit. In zijn onstabiele, kationische toestand heeft Coomassie Blue een achtergrondgolflengte van 465 nm en geeft het een roodbruine kleur af. Wanneer Coomassie Blue zich bindt aan eiwit in een zure oplossing, verschuift de achtergrondgolflengte naar 595 nm en geeft de kleurstof een helderblauwe kleur af. Eiwitten in de test binden Coomassie-blauw in ongeveer 2 minuten en het eiwit-kleurstofcomplex is ongeveer een uur stabiel, hoewel het wordt aanbevolen om de absorptiemetingen binnen 5 tot 20 minuten na aanvang van de reactie te doen. De eiwitconcentratie in de Bradford-assay kan vervolgens worden gemeten met behulp van een spectrofotometer voor zichtbaar licht en vereist daarom geen uitgebreide apparatuur.

Deze methode is in 1975 ontwikkeld door Marion M. Bradford en heeft aanzienlijk snellere, nauwkeurigere eiwitkwantificering mogelijk gemaakt in vergelijking met eerdere methoden: de Lowry-procedure en de biureet-assay. In tegenstelling tot de vorige methoden is de Bradford-assay niet gevoelig voor interferentie door verschillende niet-eiwitmoleculen, waaronder ethanol, natriumchloride en magnesiumchloride. Het is echter gevoelig voor beïnvloeding door sterke alkalische buffermiddelen, zoals natriumdodecylsulfaat (SDS).

Macromolecuul blotting en sonderen

De termen Northern, Western en Eastern blotting zijn afgeleid van wat aanvankelijk een moleculair biologische grap was die werd gespeeld op de term Southern blotting, naar de door Edwin Southern beschreven techniek voor de hybridisatie van geblot DNA. Patricia Thomas, ontwikkelaar van de RNA-blot die toen bekend werd als de Northern-blot, gebruikte de term eigenlijk niet.

zuidelijke blotting

De Southern-blot, genoemd naar zijn uitvinder, bioloog Edwin Southern, is een methode om de aanwezigheid van een specifieke DNA-sequentie in een DNA-monster te onderzoeken. DNA-monsters voor of na digestie met restrictie-enzym (restrictie-endonuclease) worden gescheiden door gelelektroforese en vervolgens overgebracht naar een membraan door middel van blotting via capillaire werking . Het membraan wordt vervolgens blootgesteld aan een gelabelde DNA-probe die een complementbase-sequentie heeft met de sequentie op het DNA van belang. Southern blotting wordt minder vaak gebruikt in laboratoriumwetenschap vanwege het vermogen van andere technieken, zoals PCR, om specifieke DNA-sequenties van DNA-monsters te detecteren. Deze blots worden echter nog steeds gebruikt voor sommige toepassingen, zoals het meten van het aantal transgenkopieën in transgene muizen of bij de engineering van gen-knock-out embryonale stamcellijnen .

Northern blotting

Northern blot-diagram

De Northern-blot wordt gebruikt om de aanwezigheid van specifieke RNA-moleculen te bestuderen als relatieve vergelijking tussen een reeks verschillende RNA-monsters. Het is in wezen een combinatie van denaturerende RNA-gelelektroforese en een blot . In dit proces wordt RNA gescheiden op basis van grootte en vervolgens overgebracht naar een membraan dat vervolgens wordt onderzocht met een gelabeld complement van een sequentie van belang. De resultaten kunnen op verschillende manieren worden gevisualiseerd, afhankelijk van het gebruikte label; de meeste resulteren echter in de onthulling van banden die de grootte van het in het monster gedetecteerde RNA vertegenwoordigen. De intensiteit van deze banden is gerelateerd aan de hoeveelheid van het doel-RNA in de geanalyseerde monsters. De procedure wordt vaak gebruikt om te bestuderen wanneer en hoeveel genexpressie plaatsvindt door te meten hoeveel van dat RNA aanwezig is in verschillende monsters, ervan uitgaande dat er geen post-transcriptionele regulatie plaatsvindt en dat de niveaus van mRNA proportionele niveaus van het corresponderende eiwit weerspiegelen geproduceerd. Het is een van de meest elementaire instrumenten om te bepalen op welk moment en onder welke omstandigheden bepaalde genen tot expressie worden gebracht in levende weefsels.

Western blotting

Een western blot is een techniek waarmee specifieke eiwitten kunnen worden gedetecteerd uit een mengsel van eiwitten. Western-blots kunnen worden gebruikt om de grootte van geïsoleerde eiwitten te bepalen en om hun expressie te kwantificeren. Bij western blotting worden eiwitten eerst op grootte gescheiden in een dunne gel die is ingeklemd tussen twee glasplaten in een techniek die bekend staat als SDS-PAGE . De eiwitten in de gel worden vervolgens overgebracht naar een polyvinylideenfluoride (PVDF), nitrocellulose, nylon of ander ondersteunend membraan. Dit membraan kan vervolgens worden gesondeerd met oplossingen van antilichamen . Antilichamen die specifiek binden aan het eiwit van belang kunnen vervolgens worden gevisualiseerd door een verscheidenheid aan technieken, waaronder gekleurde producten, chemiluminescentie of autoradiografie . Vaak zijn de antilichamen gelabeld met enzymen. Wanneer een chemiluminescent substraat wordt blootgesteld aan het enzym, is detectie mogelijk. Het gebruik van western blotting-technieken maakt niet alleen detectie mogelijk, maar ook kwantitatieve analyse. Analoge methoden voor western blotting kunnen worden gebruikt om specifieke eiwitten in levende cellen of weefselcoupes direct te kleuren .

Eastern blotting

De Eastern blotting - techniek wordt gebruikt om post-translationele modificatie van eiwitten te detecteren. Eiwitten die op het PVDF- of nitrocellulosemembraan zijn geblot, worden onderzocht op modificaties met behulp van specifieke substraten.

Microarrays

Een DNA-microarray die wordt afgedrukt
Hybridisatie van doelwit tot sonde

Een DNA-microarray is een verzameling vlekken die zijn bevestigd aan een vaste drager, zoals een microscoopglaasje, waarbij elke vlek een of meer enkelstrengs DNA- oligonucleotide - fragmenten bevat. Arrays maken het mogelijk om grote hoeveelheden zeer kleine (100 micrometer diameter) spots op één objectglaasje te zetten. Elke plek heeft een DNA-fragmentmolecuul dat complementair is aan een enkele DNA-sequentie . Een variatie op deze techniek maakt het mogelijk om de genexpressie van een organisme in een bepaald ontwikkelingsstadium te kwalificeren ( expressieprofilering ). Bij deze techniek wordt het RNA in een weefsel geïsoleerd en omgezet in gelabeld complementair DNA (cDNA). Dit cDNA wordt vervolgens gehybridiseerd met de fragmenten op de array en visualisatie van de hybridisatie kan worden gedaan. Omdat meerdere arrays kunnen worden gemaakt met exact dezelfde positie van fragmenten, zijn ze bijzonder nuttig voor het vergelijken van de genexpressie van twee verschillende weefsels, zoals een gezond en kankerachtig weefsel. Ook kan men meten welke genen tot expressie worden gebracht en hoe die expressie verandert met de tijd of met andere factoren. Er zijn veel verschillende manieren om microarrays te fabriceren; de meest voorkomende zijn siliciumchips, objectglaasjes met vlekken van ~ 100 micrometer diameter, aangepaste arrays en arrays met grotere vlekken op poreuze membranen (macroarrays). Er kunnen overal 100 spots tot meer dan 10.000 op een bepaalde array zijn. Arrays kunnen ook gemaakt worden met andere moleculen dan DNA.

Allel-specifieke oligonucleotide

Allel-specifieke oligonucleotide (ASO) is een techniek die de detectie van enkelvoudige basemutaties mogelijk maakt zonder dat PCR of gelelektroforese nodig is. Korte (20-25 nucleotiden lang), gelabelde probes worden blootgesteld aan het niet-gefragmenteerde doel-DNA, hybridisatie vindt plaats met hoge specificiteit vanwege de korte lengte van de probes en zelfs een enkele baseverandering zal hybridisatie belemmeren. Het doelwit-DNA wordt vervolgens gewassen en de gelabelde probes die niet hybridiseerden, worden verwijderd. Het doel-DNA wordt vervolgens geanalyseerd op de aanwezigheid van de probe via radioactiviteit of fluorescentie. In dit experiment moet, zoals bij de meeste moleculair-biologische technieken, een controle worden gebruikt om succesvolle experimenten te garanderen.

In de moleculaire biologie worden procedures en technologieën voortdurend ontwikkeld en oudere technologieën verlaten. Bijvoorbeeld, vóór de komst van DNA- gelelektroforese ( agarose of polyacrylamide ), werd de grootte van DNA-moleculen typisch bepaald door snelheidssedimentatie in sucrosegradiënten , een langzame en arbeidsintensieve techniek die dure instrumentatie vereist; voorafgaand aan sucrosegradiënten werd viscometrie gebruikt. Afgezien van hun historische interesse, is het vaak de moeite waard om meer te weten over oudere technologie, omdat het af en toe nuttig is om een ​​ander nieuw probleem op te lossen waarvoor de nieuwere techniek niet geschikt is.

Zie ook

Referenties

Verder lezen

Externe links