Biologia molekularna -Molecular biology

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii

Biologia molekularna / m ə ˈ l ɛ k j ʊ l ər / jest gałęzią biologii, która stara się zrozumieć molekularne podstawy aktywności biologicznej w komórkach i między komórkami, w tym syntezę molekularną, modyfikację, mechanizmy i interakcje. Badanie struktury chemicznej i fizycznej makrocząsteczek biologicznych jest znane jako biologia molekularna.

Biologia molekularna została po raz pierwszy opisana jako podejście skoncentrowane na podstawach zjawisk biologicznych - odkrywaniu struktur cząsteczek biologicznych oraz ich interakcji i wyjaśnianiu, jak te interakcje wyjaśniają obserwacje biologii klasycznej.

W 1945 roku termin biologia molekularna został użyty przez fizyka Williama Astbury'ego. Rozwój w dziedzinie biologii molekularnej nastąpił bardzo późno, aby zrozumieć, że złożony system lub korzystne podejście można uzyskać w prosty sposób, dzięki wykorzystaniu bakterii i bakteriofagów, organizm ten dostarcza informacji o podstawowych procesach biologicznych łatwiej niż komórka zwierzęca. W 1953 roku dwaj młodzi mężczyźni, Francis Crick i James Watson, pracujący w jednostce Medical Research Council, laboratorium Cavendish w Cambridge (obecnie Laboratorium Biologii Molekularnej MRC ), stworzyli model podwójnej helisy DNA, który zmienił cały scenariusz badawczy, w którym zaproponowali DNA. Struktura oparta na wcześnizych badaniach przeprowadzonych przez Rosalind Franklin i Maurice Wilkins, następnie badania doprowadziły do ​​znalezienia materiału DNA w innych mikroorganizmach, roślinach i zwierzętach.

Biologia molekularna to nie tylko badanie cząsteczek biologicznych i ich interakcji; jest to raczej zbiór technik opracowanych od powstania tej dziedziny, które umożliwiły naukowcom poznanie procesów molekularnych. Jedną z godnych uwagi technik, która zrewolucjonizowała tę dziedzinę, jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), która została opracowana w 1983 roku. .

Centralny dogmat biologii molekularnej opisuje proces, w którym DNA jest transkrybowane na RNA, które jest następnie tłumaczone na białko.

Biologia molekularna odgrywa również kluczową rolę w zrozumieniu struktur, funkcji i kontroli wewnętrznych w poszczególnych komórkach, z których wszystkie można wykorzystać do skutecznego ukierunkowania na nowe leki, diagnozowania chorób i lepszego zrozumienia fizjologii komórki. Niektóre badania kliniczne i terapie medyczne wywodzące się z biologii molekularnej są objęte terapią genową, podczas gdy zastosowanie biologii molekularnej lub molekularnej biologii komórkowej w medycynie jest obecnie określane jako medycyna molekularna .

Historia biologii molekularnej

Biologia molekularna znajduje się na przecięciu biochemii i genetyki; gdy te dyscypliny naukowe pojawiły się i ewoluowały w XX wieku, stało się jasne, że obie starają się określić mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw ważnych funkcji komórkowych. Postępy biologii molekularnej są ściśle związane z rozwojem nowych technologii i ich optymalizacją. Biologia molekularna została wyjaśniona dzięki pracy wielu naukowców, a zatem historia tej dziedziny zależy od zrozumienia tych naukowców i ich eksperymentów.

Wszystko zaczyna się od zjawiska transformacji bakterii, w 1928 Frederick Griffith zaobserwował zjawisko transformacji jednej bakterii w drugą [obecnie znane jako transformacja genetyczna]. W tym czasie nie potrafił wyjaśnić fenomenu transformacji. Później w 1944 roku trzech naukowców Oswald Avery, Colin Macleod i Maclyn McCarty zademonstrowało całe zjawisko transformacji bakterii. Po dwóch latach w 1930 roku biologia molekularna została uznana za oficjalną gałąź nauki. Ale termin „Biologia Molekularna” został ukuty dopiero w 1938 roku i zrobił to naukowiec Warren Weaver, który pracował jako dyrektor nauk przyrodniczych w Fundacji Rockefellera.

Z kolejnego eksperymentu wywnioskowano, że DNA jest podstawowym materiałem genetycznym, który spowodował zmiany genetyczne. Wiadomo było, że podstawowy skład DNA zawiera cztery zasady znane jako – Adenina, Guanina, Tymina i Cytozyna. Tak więc na podstawie składu chemicznego i krystalografii rentgenowskiej wykonanej przez Maurice'a Wilkinsa i Rosalind Franklin strukturę DNA zaproponowali James Watson i Francis Crick. Zanim jednak Watson i Crick zaproponowali strukturę DNA, w 1950 r. urodzony w Austrii naukowiec Erwin Chargaff zaproponował teorię/regułę [dziś znaną jako reguła Chargaffa], która głosiła, że ​​liczba adeniny i tyminy oraz guaniny i cytozyny jest równa proporcja.

Zasada Chargaffa

„Reguła Chargaffa stwierdzała, że ​​DNA z dowolnego gatunku dowolnego organizmu powinno mieć stosunek stechiometryczny puryn i pirymidyn 1:1 (tj. A+G=T+C), a dokładniej, że ilość guaniny powinna być równa cytozynie a ilość adeniny powinna być równa tyminy . Ten wzór znajduje się w obu niciach DNA”.

Dziedzina genetyki powstała jako próba zrozumienia molekularnych mechanizmów dziedziczenia genetycznego i struktury genu . Gregor Mendel był pionierem tej pracy w 1866 roku, kiedy po raz pierwszy napisał prawa dziedziczenia genetycznego w oparciu o swoje badania krzyżówek godowych w roślinach grochu. Jednym z takich praw dziedziczenia genetycznego jest prawo segregacji, które mówi, że osobniki diploidalne z dwoma allelami dla konkretnego genu przekażą jeden z tych alleli swojemu potomstwu. Z powodu jego krytycznej pracy, badania nad dziedziczeniem genetycznym są powszechnie określane jako genetyka Mendla .

Ważnym kamieniem milowym w biologii molekularnej było odkrycie struktury DNA. Praca ta rozpoczęła się w 1869 roku przez Friedricha Mieschera, szwajcarskiego biochemika, który jako pierwszy zaproponował strukturę zwaną nukleiną, o której teraz wiemy, że jest kwasem dezoksyrybonukleinowym lub DNA. Odkrył tę wyjątkową substancję, badając składniki bandaży wypełnionych ropą i zauważając wyjątkowe właściwości „substancji zawierających fosfor”. Innym znaczącym wkładem w model DNA był Phoebus Levene, który zaproponował „model polinukleotydowy” DNA w 1919 w wyniku swoich biochemicznych eksperymentów na drożdżach. W 1950 roku Erwin Chargaff rozszerzył prace Levene'a i wyjaśnił kilka krytycznych właściwości kwasów nukleinowych: po pierwsze, sekwencja kwasów nukleinowych różni się w zależności od gatunku. Po drugie, całkowite stężenie puryn (adeniny i guaniny) jest zawsze równe całkowitemu stężeniu pirymidyn (cysteiny i tyminy). Jest to obecnie znane jako reguła Chargaffa. W 1953 James Watson i Francis Crick opublikowali podwójną helikalną strukturę DNA, korzystając z krystalografii rentgenowskiej wykonanej przez Rosalind Franklin i Maurice'a Wilkinsa . Watson i Crick opisali strukturę DNA i snuli domysły na temat konsekwencji tej unikalnej struktury dla możliwych mechanizmów replikacji DNA.

JD Watson i FHC Crick otrzymali nagrodę Nobla w 1962 roku wraz z Maurice Wilkens za zaproponowanie modelu struktury DNA.

Z biegiem czasu w 1964 roku KA Marcker i Frederick Sanger odkryli w E.coli osobliwy amioacylo-tRNA o nazwie N-formylo-metionyl – tRNA i wyjaśnili, że cząsteczka ta odgrywa rolę w szczególnym mechanizmie wydłużania łańcucha. Otrzymał drugą nagrodę Nobla za odkrycie pełnej sekwencji 5400 nukleotydów jednoniciowego DNA bakteriofagów F´174.

W 1961 roku wykazano, że kiedy gen koduje białko, trzy kolejne zasady DNA genu określają każdy kolejny aminokwas białka. Zatem kod genetyczny jest kodem trypletowym, gdzie każdy tryplet (zwany kodonem) określa konkretny aminokwas. Ponadto wykazano, że kodony nie nakładają się na siebie w sekwencji DNA kodującej białko i że każda sekwencja jest odczytywana z ustalonego punktu początkowego.

W latach 1962-1964, dzięki zastosowaniu warunkowych śmiertelnych mutantów wirusa bakteryjnego, dokonano fundamentalnych postępów w zrozumieniu funkcji i interakcji białek wykorzystywanych w mechanizmie replikacji DNA, naprawy DNA, rekombinacji DNA oraz w montażu. struktur molekularnych.

Schematyczne przedstawienie struktury DNA Watsona i Cricka
Opis kąta w strukturze DNA

Eksperyment F. Griffitha

Schematyczne przedstawienie eksperymentu

W 1928 roku Fredrick Griffith natknął się na wirulencję bakterii pneumokoków, która zabijała szczury laboratoryjne. Według Mendla, rozpowszechniony w tamtych czasach, transfer genów mógł nastąpić tylko z komórek rodzicielskich do komórek potomnych. Griffith wysunął inną teorię, stwierdzając, że transfer genów zachodzący u członka tego samego pokolenia jest znany jako horyzontalny transfer genów (HGT). Zjawisko to jest obecnie określane jako transformacja genetyczna.

Griffith zajął się bakterią Streptococcus pneumoniae, która miała dwa różne szczepy, jeden zjadliwy i gładki, a drugi niezjadliwy i szorstki. Gładki szczep miał połyskliwy wygląd dzięki obecności swoistego rodzaju polisacharydu – polimeru glukozy i otoczki kwasu glukuronowego. Ze względu na tę polisacharydową warstwę bakterii układ odpornościowy gospodarza nie może rozpoznać bakterii i zabija gospodarza. Drugi, niezjadliwy, szorstki szczep nie ma tej polisacharydowej otoczki i ma matowy, szorstki wygląd.

Wiadomo, że obecność lub brak torebki w szczepie jest uwarunkowana genetycznie. Gładkie i szorstkie szczepy występują w kilku różnych typach, takich jak odpowiednio SI, S-II, S-III itd. oraz RI, R-II, R-III itd. Wszystkie te podtypy bakterii S i R różnią się między sobą typem antygenu, który wytwarzają.

Eksperyment Hershey i Chase

Eksperyment Hershey i Chase

Potwierdzenie, że DNA jest materiałem genetycznym, który jest przyczyną infekcji, pochodzi z eksperymentu Hershey i Chase. Do eksperymentu użyli E.coli i bakteriofaga. Ten eksperyment jest również znany jako eksperyment z blenderem, ponieważ blender kuchenny był używany jako główny element aparatury. Alfred Hershey i Martha Chase wykazali, że DNA wstrzykiwane przez cząsteczkę faga do bakterii zawiera wszystkie informacje wymagane do syntezy potomnych cząstek faga. Wykorzystali radioaktywność do oznaczenia płaszcza białkowego bakteriofaga radioaktywną siarką i DNA radioaktywnym fosforem, odpowiednio do dwóch różnych probówek. Po zmieszaniu bakteriofaga i E.coli z probówką rozpoczyna się okres inkubacji, w którym fag przekształca materiał genetyczny w komórkach E.coli . Następnie mieszaninę miesza się lub miesza, co powoduje oddzielenie faga od komórek E.coli . Całą mieszaninę odwirowuje się, a osad zawierający komórki E. coli sprawdza się, a supernatant odrzuca. Komórki E.coli wykazywały radioaktywny fosfor, co wskazywało, że transformowanym materiałem był DNA, a nie płaszcz białkowy.

Transformowany DNA przyłącza się do DNA E. coli, a radioaktywność jest widoczna tylko na DNA bakteriofaga. To zmutowane DNA można przekazać następnemu pokoleniu i powstała teoria transdukcji. Transdukcja to proces, w którym DNA bakterii przenosi fragment bakteriofagów i przekazuje go następnemu pokoleniu. Jest to również rodzaj horyzontalnego transferu genów.

Nowoczesna biologia molekularna

W miarę zbliżania się do połowy lat 20-tych biologia molekularna wkracza w złoty wiek określony zarówno przez pionowy, jak i poziomy rozwój techniczny. Wertykalnie nowe technologie umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym procesów biologicznych na poziomie atomowym. Biolodzy molekularni mają dziś dostęp do coraz bardziej przystępnych danych sekwencjonowania na coraz większych głębokościach, co ułatwia opracowywanie nowatorskich metod manipulacji genetycznych w nowych organizmach niemodelowych. Podobnie syntetyczni biolodzy molekularni będą napędzać przemysłową produkcję małych i makrocząsteczek poprzez wprowadzenie egzogennych szlaków metabolicznych w różnych liniach komórek prokariotycznych i eukariotycznych.

W ujęciu horyzontalnym dane sekwencjonowania stają się coraz bardziej przystępne cenowo i wykorzystywane w wielu różnych dziedzinach naukowych. Będzie to napędzać rozwój przemysłu w krajach rozwijających się i zwiększyć dostępność dla indywidualnych badaczy. Podobnie eksperymenty edycji genów CRISPR-Cas9 mogą być teraz wymyślane i wdrażane przez osoby za mniej niż 10 000 USD w nowych organizmach, co będzie napędzać rozwój zastosowań przemysłowych i medycznych

Związek z innymi naukami biologicznymi

Schematyczne powiązanie biochemii, genetyki i biologii molekularnej

Poniższa lista opisuje punkt widzenia na interdyscyplinarne relacje między biologią molekularną a innymi pokrewnymi dziedzinami.

Chociaż naukowcy praktykują techniki specyficzne dla biologii molekularnej, często łączy się je z metodami genetyki i biochemii . Duża część biologii molekularnej ma charakter ilościowy, a ostatnio znaczną część pracy wykonano przy użyciu technik informatycznych, takich jak bioinformatyka i biologia obliczeniowa . Genetyka molekularna, badanie struktury i funkcji genów, jest jedną z najważnizych poddziedzin biologii molekularnej od początku XXI wieku. Inne gałęzie biologii są oparte na biologii molekularnej, albo bezpośrednio badając wzajemne oddziaływania cząsteczek, tak jak w biologii komórki i biologii rozwoju, lub pośrednio, gdzie techniki molekularne są wykorzystywane do wnioskowania o historycznych cechach populacji lub gatunków, jak w dziedziny biologii ewolucyjnej, takie jak genetyka populacyjna i filogenetyka . Istnieje również długa tradycja badania biomolekuł „od podstaw” lub molekularnie w biofizyce .

Techniki biologii molekularnej

Animacja DNA

Klonowanie molekularne

Obraz transdukcji

Klonowanie molekularne służy do izolacji, a następnie przeniesienia interesującej sekwencji DNA do wektora plazmidowego. Ta technologia rekombinacji DNA została po raz pierwszy opracowana w latach 60. XX wieku. W tej technice sekwencja DNA kodująca białko będące przedmiotem zainteresowania jest klonowana przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i/lub enzymów restrykcyjnych do plazmidu ( wektor ekspresyjny ). Wektor plazmidowy ma zwykle co najmniej 3 charakterystyczne cechy: początek replikacji, mice wielokrotnego klonowania (MCS) i marker selekcyjny (zwykle oporność na antybiotyki ). Dodatkowo, przed MCS znajdują się regiony promotorowe i mice startu transkrypcji, które regulują ekspresję sklonowanego genu.

Plazmid ten można wprowadzić do komórek bakteryjnych lub zwierzęcych. Wprowadzenie DNA do komórek bakteryjnych można przeprowadzić przez transformację poprzez wychwyt nagiego DNA, sprzęganie przez kontakt komórka-komórka lub transdukcję przez wektor wirusowy. Wprowadzanie DNA do komórek eukariotycznych, takich jak komórki zwierzęce, za pomocą środków fizycznych lub chemicznych nazywa się transfekcją . Dostępnych jest kilka różnych technik transfekcji, takich jak transfekcja fosforanem wapnia, elektroporacja, mikroiniekcja i transfekcja liposomami . Plazmid może być zintegrowany z genomem, co skutkuje stabilną transfekcją, lub może pozostać niezależny od genomu i ulegać tymczasowej ekspresji, zwanej transfekcją przejściową.

Kod DNA dla białka będącego przedmiotem zainteresowania znajduje się teraz w komórce i białko może być teraz wyrażane. Dostępnych jest wiele różnych systemów, takich jak indukowalne promotory i specyficzne czynniki sygnalizacji komórkowej, które pomagają w ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania na wysokim poziomie. Z komórki bakteryjnej lub eukariotycznej można następnie wyekstrahować duże ilości białka. Białko można testować pod kątem aktywności enzymatycznej w różnych sytuacjach, białko może być krystalizowane, aby można było badać jego strukturę trzeciorzędową lub, w przemyśle farmaceutycznym, można badać aktywność nowych leków przeciwko białku.

Reakcja łańcuchowa polimerazy

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to niezwykle wszechstronna technika kopiowania DNA. W skrócie, PCR pozwala na skopiowanie lub zmodyfikowanie określonej sekwencji DNA w z góry określony sposób. Reakcja jest niezwykle silna i w idealnych warunkach może wzmocnić jedną cząsteczkę DNA do 1,07 miliarda cząsteczek w mniej niż dwie godziny. PCR ma wiele zastosowań, w tym badanie ekspresji genów, wykrywanie drobnoustrojów chorobotwórczych, wykrywanie mutacji genetycznych oraz wprowadzanie mutacji do DNA. Technikę PCR można stosować do wprowadzania mic restrykcyjnych na końcach cząsteczek DNA lub do mutowania określonych zasad DNA, ta ostatnia jest metodą określaną jako mutageneza ukierunkowana na mice . PCR może być również użyty do określenia, czy dany fragment DNA znajduje się w bibliotece cDNA . PCR ma wiele odmian, takich jak PCR z odwrotną transkrypcją ( RT-PCR ) do amplifikacji RNA oraz, ostatnio, ilościowy PCR, który umożliwia ilościowy pomiar cząsteczek DNA lub RNA.

Dwuprocentowy żel agarozowy w buforze boranowym wylany na tacce żelowej.

Elektroforeza żelowa

STRONA SDS

Elektroforeza żelowa to technika rozdzielania cząsteczek według ich wielkości za pomocą żelu agarozowego lub poliakryloamidowego. Ta technika jest jednym z głównych narzędzi biologii molekularnej. Podstawową zasadą jest to, że fragmenty DNA można oddzielić przez przyłożenie prądu elektrycznego przez żel - ponieważ szkielet DNA zawiera ujemnie naładowane grupy fosforanowe, DNA będzie migrować przez żel agarozowy w kierunku dodatniego końca prądu. Białka można również rozdzielać na podstawie wielkości przy użyciu żelu SDS-PAGE lub na podstawie wielkości i ich ładunku elektrycznego przy użyciu tak zwanej elektroforezy żelowej 2D .

Białka wybarwione na żelu PAGE przy użyciu błękitu Coomassie.

Test Bradforda

Test Bradforda to technika biologii molekularnej, która umożliwia szybkie i dokładne oznaczenie ilościowe cząsteczek białka z wykorzystaniem unikalnych właściwości barwnika o nazwie Coomassie Brilliant Blue G-250. Coomassie Blue ulega widocznej zmianie koloru z czerwonobrązowego na jasnoniebieski po związaniu z białkiem. W swoim niestabilnym, kationowym stanie, Coomassie Blue ma długość fali tła 465 nm i emituje czerwonawo-brązowy kolor. Kiedy Coomassie Blue wiąże się z białkiem w kwaśnym roztworze, długość fali tła przesuwa się do 595 nm, a barwnik wydziela jasnoniebieski kolor. Białka w teście wiążą błękit Coomassie w około 2 minuty, a kompleks białko-barwnik jest stabilny przez około godzinę, chociaż zaleca się, aby odczyty absorbancji dokonywać w ciągu 5 do 20 minut od rozpoczęcia reakcji. Stężenie białka w teście Bradforda można następnie zmierzyć za pomocą spektrofotometru światła widzialnego, a zatem nie wymaga on rozbudowanego sprzętu.

Metoda ta została opracowana w 1975 roku przez Marion M. Bradford i umożliwiła znacznie szybsze i dokładnize oznaczenie ilościowe białka w porównaniu z poprzednimi metodami: procedurą Lowry'ego i testem biuretowym. W przeciwieństwie do poprzednich metod, test Bradforda nie jest podatny na interferencję ze strony kilku cząsteczek niebiałkowych, w tym etanolu, chlorku sodu i chlorku magnezu. Jest jednak podatny na działanie silnych alkalicznych środków buforujących, takich jak dodecylosiarczan sodu (SDS).

Blotowanie i sondowanie makrocząsteczek

Terminy Northern, Western i Eastern blotting wywodzą się z tego, co początkowo było żartem z biologii molekularnej, który odgrywał rolę w terminologii Southern blotting, po technice opisanej przez Edwina Southerna do hybrydyzacji poddanego blottingowi DNA. Patricia Thomas, twórca blottingu RNA, który później stał się znany jako Northern blotting, w rzeczywistości nie użyła tego terminu.

Southern blotting

Nazwany na cześć jego wynalazcy, biologa Edwina Southerna, Southern blot jest metodą sondowania obecności określonej sekwencji DNA w próbce DNA. Próbki DNA przed lub po trawieniu enzymem restrykcyjnym (endonukleazą restrykcyjną) są rozdzielane przez elektroforezę żelową, a następnie przenoszone na membranę przez blotting poprzez działanie kapilarne . Błonę następnie eksponuje się na znakowaną sondę DNA, która ma sekwencję zasad dopełniacza do sekwencji na interesującym DNA. Southern blot jest rzadziej stosowany w nauce laboratoryjnej ze względu na zdolność innych technik, takich jak PCR, do wykrywania określonych sekwencji DNA z próbek DNA. Te bloty są jednak nadal używane w niektórych zastosowaniach, takich jak pomiar liczby kopii transgenu u transgenicznych myszy lub w inżynierii linii embrionalnych komórek macierzystych z nokautem genów .

Północna blotting

Schemat Northern blot

Northern blot służy do badania obecności określonych cząsteczek RNA jako względnego porównania pomiędzy zestawem różnych próbek RNA . Jest to zasadniczo połączenie elektroforezy w żelu denaturującym RNA i blottingu . W tym procesie RNA jest rozdzielany na podstawie wielkości, a następnie przenoszony na błonę, która jest następnie sondowana znakowanym dopełnieniem interesującej sekwencji. Wyniki można wizualizować na różne sposoby, w zależności od użytej etykiety; jednak większość skutkuje ujawnieniem prążków reprezentujących rozmiary RNA wykrytego w próbce. Intensywność tych prążków jest związana z ilością docelowego RNA w analizowanych próbkach. Procedura jest powszechnie stosowana do badania, kiedy i jaka jest ekspresja genu, mierząc, ile tego RNA jest obecne w różnych próbkach, zakładając, że nie zachodzi regulacja potranskrypcyjna i że poziomy mRNA odzwierciedlają proporcjonalne poziomy odpowiedniego białka wytworzony. Jest to jedno z najbardziej podstawowych narzędzi pozwalających określić, w jakim czasie iw jakich warunkach dochodzi do ekspresji określonych genów w żywych tkankach.

Western blotting

Western blot to technika, dzięki której z mieszaniny białek można wykryć określone białka. Western blot można wykorzystać do określenia wielkości izolowanych białek, a także do ilościowej oceny ich ekspresji. W metodzie Western blotting białka są najpierw rozdzielane według wielkości w cienkim żelu umieszczonym pomiędzy dwiema szklanymi płytkami w technice znanej jako SDS-PAGE . Białka w żelu są następnie przenoszone na polifluorek winylidenu (PVDF), nitrocelulozę, nylon lub inną błonę podtrzymującą. Błonę tę można następnie sondować roztworami przeciwciał . Przeciwciała, które specyficznie wiążą się z danym białkiem, można następnie wizualizować różnymi technikami, w tym produktami barwnymi, chemiluminescencją lub autoradiografią . Często przeciwciała są znakowane enzymami. Gdy substrat chemiluminescencyjny zostanie wystawiony na działanie enzymu, umożliwia to wykrycie. Zastosowanie technik Western blot pozwala nie tylko na detekcję, ale także na analizę ilościową. Metody analogiczne do western blotting mogą być stosowane do bezpośredniego barwienia określonych białek w żywych komórkach lub skrawkach tkanek .

Wschodnia blotting

Do wykrywania potranslacyjnych modyfikacji białek wykorzystywana jest technika Eastern blotting . Białka naniesione na błonę PVDF lub nitrocelulozową są badane pod kątem modyfikacji przy użyciu określonych substratów.

Mikromacierze

Drukowana mikromacierz DNA
Hybrydyzacja celu z sondą

Mikromacierz DNA to zbiór plamek przymocowanych do stałego podłoża, takiego jak szkiełko mikroskopowe, gdzie każda plamka zawiera jeden lub więcej jednoniciowych fragmentów oligonukleotydów DNA. Tablice umożliwiają naniesienie dużej ilości bardzo małych (średnica 100 mikrometrów) plamek na jednym szkiełku. Każda plamka ma cząsteczkę fragmentu DNA, która jest komplementarna do pojedynczej sekwencji DNA . Odmiana tej techniki pozwala na zakwalifikowanie ekspresji genów organizmu na określonym etapie rozwoju ( profilowanie ekspresji ). W tej technice RNA w tkance jest izolowane i przekształcane w znakowany komplementarny DNA (cDNA). Ten cDNA jest następnie hybrydyzowany z fragmentami na macierzy i można przeprowadzić wizualizację hybrydyzacji. Ponieważ można wykonać wiele macierzy z dokładnie tym samym położeniem fragmentów, są one szczególnie przydatne do porównywania ekspresji genów w dwóch różnych tkankach, takich jak tkanka zdrowa i rakowa. Można również zmierzyć, jakie geny ulegają ekspresji i jak ta ekspresja zmienia się w czasie lub z innymi czynnikami. Istnieje wiele różnych sposobów wytwarzania mikromacierzy; najczęściej spotykane są chipy krzemowe, szkiełka mikroskopowe z plamkami o średnicy ~100 mikrometrów, niestandardowe macierze i macierze z większymi plamami na porowatych membranach (makromacierze). Na danej tablicy może znajdować się od 100 mic do ponad 10 000. Tablice można również tworzyć z molekułami innymi niż DNA.

Oligonukleotyd specyficzny dla alleli

Oligonukleotyd specyficzny dla alleli (ASO) to technika, która umożliwia wykrycie mutacji pojedynczych zasad bez potrzeby PCR lub elektroforezy żelowej. Krótkie (20-25 nukleotydów długości), znakowane sondy są eksponowane na nie pofragmentowany docelowy DNA, hybrydyzacja zachodzi z wysoką specyficznością ze względu na krótką długość sond, a nawet pojedyncza zmiana zasady utrudnia hybrydyzację. Docelowy DNA jest następnie płukany, a znakowane sondy, które nie hybrydyzowały, są usuwane. Docelowy DNA jest następnie analizowany pod kątem obecności sondy poprzez radioaktywność lub fluorescencję. W tym eksperymencie, podobnie jak w większości technik biologii molekularnej, należy zastosować kontrolę, aby zapewnić pomyślne eksperymenty.

W biologii molekularnej stale rozwijane są procedury i technologie, a starsze technologie porzucane. Na przykład, przed pojawieniem się elektroforezy w żelu DNA ( agaroza lub poliakrylamid ), wielkość cząsteczek DNA była typowo określana przez szybkość sedymentacji w gradientach sacharozy, powolną i pracochłonną technikę wymagającą kosztownego oprzyrządowania; przed gradientami sacharozy zastosowano wiskozymetrię . Poza ich historycznym zainteresowaniem, często warto wiedzieć o starszej technologii, ponieważ czasami przydatne jest rozwiązanie innego nowego problemu, dla którego nowsza technika jest nieodpowiednia.

Zobacz też

Bibliografia

Dalsza lektura

Zewnętrzne linki