Biologie moleculara -Molecular biology

De la Wikipedia, enciclopedia liberă

Biologia moleculară / m ə ˈ l ɛ k j ʊ l ər / este ramura biologiei care încearcă să înțeleagă baza moleculară a activității biologice în și între celule, inclusiv sinteza moleculară, modificarea, mecanismele și interacțiunile. Studiul structurii chimice și fizice a macromoleculelor biologice este cunoscut sub numele de biologie moleculară.

Biologia moleculară a fost descrisă pentru prima dată ca o abordare concentrată pe fundamentele fenomenelor biologice - descoperirea structurilor moleculelor biologice, precum și a interacțiunilor lor și modul în care aceste interacțiuni explică observațiile biologiei clasice.

În 1945, termenul de biologie moleculară a fost folosit de către fizicianul William Astbury. Dezvoltarea în domeniul biologiei moleculare a avut loc foarte târziu pentru a înțelege că sistemul complex sau abordarea avantajoasă ar fi făcută într-un mod simplu de înțelegere prin utilizarea bacteriilor și bacteriofagelor, acest organism furnizează informații despre procesul biologic de bază mai ușor decât celula animală. În 1953, doi tineri pe nume Francis Crick și James Watson, care lucrau la unitatea Medical Research Council, laboratorul Cavendish, Cambridge (acum Laboratorul MRC de Biologie Moleculară ), au realizat un model cu dublu helix al ADN-ului care a schimbat întreg scenariul de cercetare pe care l-au propus ADN-ul. structura bazată pe cercetările anterioare făcute de Rosalind Franklin și Maurice Wilkins, apoi cercetările au condus la găsirea de material ADN în alte microorganisme, plante și animale.

Biologia moleculară nu este doar studiul moleculelor biologice și al interacțiunilor lor; mai degrabă, este, de asemenea, o colecție de tehnici dezvoltate de la geneza domeniului care au permis oamenilor de știință să învețe despre procesele moleculare. O tehnică notabilă care a revoluționat domeniul este reacția în lanț a polimerazei (PCR), care a fost dezvoltată în 1983. PCR este o reacție care amplifică cantități mici de ADN și este utilizată în multe aplicații în diverse discipline științifice, așa cum va fi discutat mai târziu. .

Dogma centrală a biologiei moleculare descrie procesul prin care ADN-ul este transcris în ARN, care este apoi tradus în proteină.

Biologia moleculară joacă, de asemenea, un rol esențial în înțelegerea structurilor, funcțiilor și controalelor interne din celulele individuale, toate acestea putând fi utilizate pentru a viza în mod eficient noile medicamente, pentru a diagnostica bolile și pentru a înțelege mai bine fiziologia celulară. Unele cercetări clinice și terapii medicale care decurg din biologia moleculară sunt acoperite de terapia genică, în timp ce utilizarea biologiei moleculare sau a biologiei celulare moleculare în medicină este acum denumită medicină moleculară .

Istoria biologiei moleculare

Biologia moleculară se află la intersecția dintre biochimie și genetică; pe măsură ce aceste discipline științifice au apărut și au evoluat în secolul al XX-lea, a devenit clar că ambele au căutat să determine mecanismele moleculare care stau la baza funcțiilor celulare vitale. Progresele în biologia moleculară au fost strâns legate de dezvoltarea de noi tehnologii și optimizarea acestora. Biologia moleculară a fost elucidată de munca multor oameni de știință și, astfel, istoria domeniului depinde de înțelegerea acestor oameni de știință și a experimentelor lor.

Totul începe cu fenomenul de transformare în bacterii, în 1928, Frederick Griffith, a observat un fenomen de transformare de la o bacterie la alta [cunoscută acum ca transformare genetică]. În acel moment, el nu putea explica fenomenul de transformare. Mai târziu, în 1944, trei oameni de știință Oswald Avery, Colin Macleod și Maclyn McCarty au demonstrat întregul fenomen de transformare a bacteriilor. După doi ani, în 1930, biologia moleculară a fost stabilită ca ramură oficială a științei. Dar termenul de „biologie moleculară” nu a fost inventat până în 1938 și asta a fost făcut de omul de știință Warren Weaver, care lucra ca director de științe naturale la Fundația Rockefeller.

Din experimentul următor sa concluzionat că ADN-ul este materialul genetic de bază care a cauzat modificările genetice. Compoziția de bază a ADN-ului era cunoscută că conține patru baze cunoscute sub numele de - Adenină, Guanină, Timină și Citozină. Deci, pe baza compoziției chimice și a cristalografiei cu raze X, realizată de Maurice Wilkins și Rosalind Franklin, structura ADN-ului a fost propusă de James Watson și Francis Crick. Dar, înainte ca Watson și Crick să propună structura ADN-ului, în 1950, omul de știință de origine austriacă Erwin Chargaff a propus teoria/regula [cunoscută astăzi sub numele de regula lui Chargaff], care afirma că numărul de adenină și timină și guanină și citozină sunt egale. proporţie.

Regula lui Chargaff

„Regula lui Chargaff spunea că ADN-ul de la orice specie a oricărui organism ar trebui să aibă un raport stoichiometric de 1:1 de purine și pirimidine (adică, A+G=T+C) și, mai precis, că cantitatea de guanină ar trebui să fie egală cu citozină . iar cantitatea de adenină ar trebui să fie egală cu timină . Acest model se găsește în ambele catene ale ADN-ului".

Domeniul geneticii a apărut ca o încercare de a înțelege mecanismele moleculare ale moștenirii genetice și structura unei gene . Gregor Mendel a fost pionier în această lucrare în 1866, când a scris pentru prima dată legile moștenirii genetice pe baza studiilor sale despre încrucișările de împerechere la plantele de mazăre. O astfel de lege a moștenirii genetice este legea segregării, care afirmă că indivizii diploizi cu două alele pentru o anumită genă vor transmite una dintre aceste alele descendenților lor. Datorită muncii sale critice, studiul moștenirii genetice este denumit în mod obișnuit genetica mendeliană .

O piatră de hotar majoră în biologia moleculară a fost descoperirea structurii ADN-ului. Această lucrare a început în 1869 de Friedrich Miescher, un biochimist elvețian care a propus pentru prima dată o structură numită nucleină, despre care acum știm că este acid dezoxiribonucleic sau ADN. El a descoperit această substanță unică studiind componentele bandajelor umplute cu puroi și remarcând proprietățile unice ale „substanțelor care conțin fosfor”. Un alt contributor notabil la modelul ADN a fost Phoebus Levene, care a propus „modelul polinucleotidic” al ADN-ului în 1919, ca rezultat al experimentelor sale biochimice pe drojdie. În 1950, Erwin Chargaff a extins lucrările lui Levene și a elucidat câteva proprietăți critice ale acizilor nucleici: în primul rând, secvența acizilor nucleici variază în funcție de specie. În al doilea rând, concentrația totală de purine (adenină și guanină) este întotdeauna egală cu concentrația totală de pirimidine (cisteină și timină). Aceasta este acum cunoscută sub numele de regula lui Chargaff. În 1953, James Watson și Francis Crick au publicat structura dublă elicoidală a ADN-ului, folosind lucrările de cristalografie cu raze X realizate de Rosalind Franklin și Maurice Wilkins . Watson și Crick au descris structura ADN-ului și au făcut presupuneri despre implicațiile acestei structuri unice pentru posibilele mecanisme de replicare a ADN-ului.

JD Watson și FHC Crick au primit premiul Nobel în 1962, împreună cu Maurice Wilkens, pentru că au propus un model al structurii ADN-ului.

Odată cu trecerea timpului, în 1964, KA Marcker și Frederick Sanger au descoperit un amioacil-ARNt particular în E.coli, numit N-formil-metionil – ARNt și au explicat că această moleculă joacă un rol în mecanismul special de alungire a lanțului. A primit al doilea premiu Nobel pentru descoperirea unei secvențe complete de 5.400 de nucleotide de ADN monocatenar al bacteriofagelor F´174.

În 1961, s-a demonstrat că atunci când o genă codifică o proteină, trei baze secvenţiale ale ADN -ului unei gene specifică fiecare aminoacid succesiv al proteinei. Astfel, codul genetic este un cod triplet, unde fiecare triplet (numit codon) specifică un anumit aminoacid. Mai mult, s-a demonstrat că codonii nu se suprapun între ei în secvența de ADN care codifică o proteină și că fiecare secvență este citită de la un punct de pornire fix.

În perioada 1962-1964, prin utilizarea mutanților letali condiționati ai unui virus bacterian, s-au făcut progrese fundamentale în înțelegerea funcțiilor și interacțiunilor proteinelor folosite în mașinile de replicare a ADN-ului, reparare a ADN-ului, recombinare ADN-ului și asamblare. a structurilor moleculare.

Reprezentarea schematică a structurii ADN-ului lui Watson și Crick
Descrierea unghiului în structura ADN-ului

Experimentul F.Griffith

Reprezentarea schematică a experimentului

În 1928, Fredrick Griffith, a întâlnit o proprietate de virulență în bacteriile pneumococ, care ucidea șobolanii de laborator. Potrivit lui Mendel, predominant la acea vreme, transferul de gene ar putea avea loc numai de la celulele părinte la cele fiice. Griffith a avansat o altă teorie, afirmând că transferul de gene care are loc la membrii aceleiași generații este cunoscut sub numele de transfer orizontal de gene (HGT). Acest fenomen este denumit acum transformare genetică.

Griffith s-a adresat bacteriei Streptococcus pneumoniae, care avea două tulpini diferite, una virulentă și netedă și una avirulentă și aspră. Tulpina netedă a avut un aspect strălucitor datorită prezenței unui tip de polizaharidă specifică - un polimer al capsulei de glucoză și acid glucuronic. Datorită acestui strat polizaharidic de bacterii, sistemul imunitar al unei gazde nu poate recunoaște bacteriile și ucide gazda. Cealaltă tulpină, avirulentă, aspră, nu are această capsulă polizaharidă și are un aspect plictisitor, aspru.

Prezența sau absența capsulei în tulpină este cunoscută ca fiind determinată genetic. Tulpinile netede și aspre apar în mai multe tipuri diferite, cum ar fi SI, S-II, S-III etc. și respectiv RI, R-II, R-III etc. Toate aceste subtipuri de bacterii S și R diferă între ele prin tipul de antigen pe care îl produc.

Experimentul Hershey și Chase

Experimentul Hershey și Chase

Confirmarea faptului că ADN-ul este materialul genetic care este cauza infecției a venit din experimentul Hershey și Chase. Ei au folosit E.coli și bacteriofage pentru experiment. Acest experiment este cunoscut și sub numele de experimentul blenderului, deoarece blenderul de bucătărie a fost folosit ca o piesă majoră de aparat. Alfred Hershey și Martha Chase au demonstrat că ADN-ul injectat de o particulă de fag într-o bacterie conține toate informațiile necesare pentru a sintetiza particulele de fagi descendenți. Ei au folosit radioactivitate pentru a marca stratul de proteine ​​al bacteriofagului cu sulf radioactiv și ADN-ul cu fosfor radioactiv, în două eprubete diferite, respectiv. După amestecarea bacteriofagului și E.coli în eprubetă, începe perioada de incubație în care fagul transformă materialul genetic din celulele E.coli . Apoi amestecul este amestecat sau agitat, ceea ce separă fagul de celulele E.coli . Întregul amestec este centrifugat și peletul care conține celule E.coli a fost verificat și supernatantul a fost aruncat. Celulele E.coli au prezentat fosfor radioactiv, ceea ce a indicat că materialul transformat a fost ADN-ul, nu învelișul proteic.

ADN-ul transformat se atașează de ADN-ul E.coli și radioactivitatea este văzută doar pe ADN-ul bacteriofagului. Acest ADN mutant poate fi transmis generației următoare și a apărut teoria transducției. Transducția este un proces în care ADN-ul bacterian poartă fragmentul de bacteriofagi și îl transmite generației următoare. Acesta este, de asemenea, un tip de transfer genic orizontal.

Biologie moleculară modernă

Pe măsură ce ne apropiem de mijlocul anilor 20, biologia moleculară intră într-o epocă de aur definită atât de dezvoltarea tehnică pe verticală, cât și pe orizontală. Pe verticală, tehnologiile noi permit monitorizarea în timp real a proceselor biologice la nivel atomic. Biologii moleculari au astăzi acces la date de secvențiere din ce în ce mai accesibile la adâncimi din ce în ce mai mari, facilitând dezvoltarea de noi metode de manipulare genetică în noi organisme non-model. De asemenea, biologii moleculari sintetici vor conduce producția industrială de molecule mici și macro prin introducerea de căi metabolice exogene în diferite linii celulare procariote și eucariote.

Pe orizontală, secvențierea datelor devine din ce în ce mai accesibilă și utilizată în multe domenii științifice diferite. Acest lucru va conduce la dezvoltarea industriilor în țările în curs de dezvoltare și va crește accesibilitatea pentru cercetătorii individuali. De asemenea, experimentele de editare a genelor CRISPR-Cas9 pot fi acum concepute și implementate de către indivizi pentru mai puțin de 10.000 USD în organisme noi, ceea ce va conduce la dezvoltarea aplicațiilor industriale și medicale.

Relația cu alte științe biologice

Relația schematică între biochimie, genetică și biologie moleculară

Următoarea listă descrie un punct de vedere asupra relațiilor interdisciplinare dintre biologia moleculară și alte domenii conexe.

În timp ce cercetătorii practică tehnici specifice biologiei moleculare, este obișnuit să le combine cu metode din genetică și biochimie . O mare parte din biologia moleculară este cantitativă, iar recent o cantitate semnificativă de muncă a fost realizată folosind tehnici informatice, cum ar fi bioinformatica și biologia computațională . Genetica moleculară, studiul structurii și funcției genelor, a fost printre cele mai proeminente subdomenii ale biologiei moleculare de la începutul anilor 2000. Alte ramuri ale biologiei sunt informate de biologia moleculară, fie prin studierea directă a interacțiunilor moleculelor în sine, cum ar fi biologia celulară și biologia dezvoltării, fie indirect, în cazul în care tehnicile moleculare sunt utilizate pentru a deduce atribute istorice ale populațiilor sau speciilor, cum ar fi în domenii din biologia evoluționistă, cum ar fi genetica populației și filogenetica . Există, de asemenea, o lungă tradiție de studiere a biomoleculelor „de la zero”, sau molecular, în biofizică .

Tehnici de biologie moleculară

Animație ADN

Clonarea moleculară

Imagine de transducție

Clonarea moleculară este utilizată pentru a izola și apoi a transfera o secvență de ADN de interes într-un vector plasmid. Această tehnologie ADN recombinant a fost dezvoltată pentru prima dată în anii 1960. În această tehnică, o secvență de ADN care codifică o proteină de interes este donată utilizând reacția în lanț a polimerazei (PCR) și/sau enzime de restricție, într-o plasmidă ( vector de expresie ). Vectorul plasmidic are de obicei cel puțin 3 caracteristici distinctive: o origine de replicare, un situs de clonare multiplă (MCS) și un marker selectiv (de obicei rezistență la antibiotice ). În plus, în amonte de MCS sunt regiunile promotoare și situsul de pornire a transcripției, care reglează expresia genei donate.

Această plasmidă poate fi inserată fie în celule bacteriene, fie în celule animale. Introducerea ADN-ului în celulele bacteriene se poate face prin transformare prin absorbția ADN-ului gol, conjugare prin contact celulă-celulă sau prin transducție prin vector viral. Introducerea ADN-ului în celulele eucariote, cum ar fi celulele animale, prin mijloace fizice sau chimice, se numește transfecție . Sunt disponibile mai multe tehnici de transfecție diferite, cum ar fi transfecția cu fosfat de calciu, electroporarea, microinjecția și transfecția cu lipozomi . Plasmida poate fi integrată în genom, rezultând o transfecție stabilă, sau poate rămâne independentă de genom și exprimată temporar, numită transfecție tranzitorie.

ADN-ul care codifică o proteină de interes este acum în interiorul unei celule, iar proteina poate fi acum exprimată. O varietate de sisteme, cum ar fi promotorii inductibili și factorii specifici de semnalizare celulară, sunt disponibile pentru a ajuta la exprimarea proteinei de interes la niveluri ridicate. Cantități mari de proteină pot fi apoi extrase din celula bacteriană sau eucariotă. Proteina poate fi testată pentru activitatea enzimatică într-o varietate de situații, proteina poate fi cristalizată astfel încât structura sa terțiară poate fi studiată sau, în industria farmaceutică, activitatea noilor medicamente împotriva proteinei poate fi studiată.

Reacția polimerazei în lanț

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică extrem de versatilă pentru copierea ADN-ului. Pe scurt, PCR permite ca o anumită secvență de ADN să fie copiată sau modificată în moduri predeterminate. Reacția este extrem de puternică și în condiții perfecte ar putea amplifica o moleculă de ADN pentru a deveni 1,07 miliarde de molecule în mai puțin de două ore. PCR are multe aplicații, inclusiv studiul expresiei genelor, detectarea microorganismelor patogene, detectarea mutațiilor genetice și introducerea mutațiilor în ADN. Tehnica PCR poate fi utilizată pentru a introduce situsuri de enzime de restricție la capetele moleculelor de ADN sau pentru a muta anumite baze de ADN, aceasta din urmă fiind o metodă denumită mutageneză direcționată . PCR poate fi, de asemenea, utilizată pentru a determina dacă un anumit fragment de ADN este găsit într-o bibliotecă de ADNc . PCR are multe variații, cum ar fi PCR cu transcripție inversă ( RT-PCR ) pentru amplificarea ARN și, mai recent, PCR cantitativă care permite măsurarea cantitativă a moleculelor de ADN sau ARN.

Gel de agaroză de două procente în tampon borat turnat într-o tavă de gel.

Electroforeză cu gel

SDS-PAGE

Electroforeza pe gel este o tehnică care separă moleculele după dimensiunea lor folosind un gel de agaroză sau poliacrilamidă. Această tehnică este unul dintre instrumentele principale ale biologiei moleculare. Principiul de bază este că fragmentele de ADN pot fi separate prin aplicarea unui curent electric peste gel - deoarece coloana vertebrală a ADN-ului conține grupuri de fosfat încărcate negativ, ADN-ul va migra prin gelul de agaroză către capătul pozitiv al curentului. Proteinele pot fi, de asemenea, separate pe baza dimensiunii utilizând un gel SDS-PAGE sau pe baza dimensiunii și a încărcăturii lor electrice prin utilizarea a ceea ce este cunoscut sub numele de electroforeză pe gel 2D .

Proteine ​​colorate pe un gel PAGE folosind colorant albastru Coomassie.

Testul Bradford

Testul Bradford este o tehnică de biologie moleculară care permite cuantificarea rapidă și precisă a moleculelor de proteine ​​utilizând proprietățile unice ale unui colorant numit Coomassie Brilliant Blue G-250. Coomassie Blue suferă o schimbare vizibilă a culorii de la maro-roșcat la albastru strălucitor la legarea de proteine. În starea sa instabilă, cationică, Coomassie Blue are o lungime de undă de fundal de 465 nm și emite o culoare maro-roșcat. Când Coomassie Blue se leagă de proteine ​​​​într-o soluție acidă, lungimea de undă de fundal se schimbă la 595 nm și colorantul emite o culoare albastră strălucitoare. Proteinele din test leagă albastrul Coomassie în aproximativ 2 minute, iar complexul protein-colorant este stabil timp de aproximativ o oră, deși se recomandă ca valorile absorbanței să fie luate în decurs de 5 până la 20 de minute de la inițierea reacției. Concentrația de proteine ​​​​în testul Bradford poate fi apoi măsurată folosind un spectrofotometru cu lumină vizibilă și, prin urmare, nu necesită echipament extins.

Această metodă a fost dezvoltată în 1975 de Marion M. Bradford și a permis o cuantificare semnificativ mai rapidă și mai precisă a proteinelor în comparație cu metodele anterioare: procedura Lowry și testul biuretului. Spre deosebire de metodele anterioare, testul Bradford nu este susceptibil la interferența cu mai multe molecule non-proteice, inclusiv etanol, clorură de sodiu și clorură de magneziu. Cu toate acestea, este susceptibil de a fi influențat de agenți de tamponare alcalini puternici, cum ar fi dodecilsulfatul de sodiu (SDS).

Patarea și sondarea macromoleculelor

Termenii northern, western și eastern blotting sunt derivați din ceea ce inițial a fost o glumă de biologie moleculară care juca pe termenul Southern blotting, după tehnica descrisă de Edwin Southern pentru hibridizarea ADN-ului blotat. Patricia Thomas, dezvoltatorul ARN blot, care apoi a devenit cunoscut sub numele de northern blot, de fapt nu a folosit termenul.

Southern blot

Numit după inventatorul său, biologul Edwin Southern, Southern blot este o metodă de sondare a prezenței unei secvențe specifice de ADN într-o probă de ADN. Probele de ADN înainte sau după digestia cu enzima de restricție (endonuclează de restricție) sunt separate prin electroforeză pe gel și apoi transferate pe o membrană prin blotting prin acțiune capilară . Membrana este apoi expusă la o sondă de ADN marcată care are o secvență de bază complementară la secvența de pe ADN-ul de interes. Southern blotting este mai puțin frecvent utilizat în știința de laborator datorită capacității altor tehnici, cum ar fi PCR, de a detecta secvențe specifice de ADN din probele de ADN. Aceste pete sunt încă folosite pentru unele aplicații, totuși, cum ar fi măsurarea numărului de copii transgene la șoarecii transgenici sau în ingineria liniilor de celule stem embrionare knockout genice .

Northern blot

Diagrama Northern blot

Northern blot este utilizat pentru a studia prezența unor molecule specifice de ARN ca comparație relativă între un set de probe diferite de ARN. Este, în esență, o combinație de electroforeză pe gel de ARN denaturant și un blot . În acest proces, ARN-ul este separat în funcție de dimensiune și apoi este transferat într-o membrană care este apoi sondată cu un complement marcat al unei secvențe de interes. Rezultatele pot fi vizualizate printr-o varietate de moduri, în funcție de eticheta utilizată; cu toate acestea, majoritatea au ca rezultat descoperirea benzilor reprezentând dimensiunile ARN-ului detectat în probă. Intensitatea acestor benzi este legată de cantitatea de ARN țintă din probele analizate. Procedura este folosită în mod obișnuit pentru a studia când și cât de multă expresie genică are loc prin măsurarea cât de mult din acel ARN este prezent în diferite probe, presupunând că nu are loc nicio reglare post-transcripțională și că nivelurile de ARNm reflectă nivelurile proporționale ale proteinei corespunzătoare fiind produs. Este unul dintre cele mai de bază instrumente pentru a determina în ce moment și în ce condiții anumite gene sunt exprimate în țesuturile vii.

Western blot

Un western blot este o tehnică prin care anumite proteine ​​pot fi detectate dintr-un amestec de proteine. Western blot pot fi utilizate pentru a determina dimensiunea proteinelor izolate, precum și pentru a cuantifica expresia acestora. În western blotting, proteinele sunt mai întâi separate după dimensiune, într-un gel subțire plasat între două plăci de sticlă într-o tehnică cunoscută sub numele de SDS-PAGE . Proteinele din gel sunt apoi transferate într-o fluorură de poliviniliden (PVDF), nitroceluloză, nailon sau altă membrană suport. Această membrană poate fi apoi sondată cu soluții de anticorpi . Anticorpii care se leagă în mod specific la proteina de interes pot fi apoi vizualizați printr-o varietate de tehnici, inclusiv produse colorate, chemiluminiscență sau autoradiografie . Adesea, anticorpii sunt marcați cu enzime. Atunci când un substrat chemiluminiscent este expus la enzimă, acesta permite detectarea. Utilizarea tehnicilor de western blot permite nu numai detectarea, ci și analiza cantitativă. Metode analoge cu Western blotting pot fi utilizate pentru a colora direct proteine ​​specifice în celule vii sau secțiuni de țesut .

Eastern blotting

Tehnica eastern blotting este utilizată pentru a detecta modificarea post-translațională a proteinelor. Proteinele aplicate pe membrana PVDF sau nitroceluloză sunt testate pentru modificări folosind substraturi specifice.

Micromatrice

Se imprimă o micromatrice ADN
Hibridizarea țintei cu sondă

O micromatrice ADN este o colecție de puncte atașate la un suport solid, cum ar fi o lamă de microscop, în care fiecare punct conține unul sau mai multe fragmente de oligonucleotide ADN monocatenar . Matricele fac posibilă plasarea unor cantități mari de pete foarte mici (100 micrometri diametru) pe o singură lamă. Fiecare punct are o moleculă de fragment de ADN care este complementară unei singure secvențe de ADN . O variație a acestei tehnici permite calificarea expresiei genice a unui organism într-un anumit stadiu al dezvoltării ( profilarea expresiei ). În această tehnică, ARN-ul dintr-un țesut este izolat și convertit în ADN complementar marcat (ADNc). Acest ADNc este apoi hibridizat cu fragmentele de pe matrice și se poate face vizualizarea hibridizării. Deoarece pot fi realizate mai multe matrice cu exact aceeași poziție a fragmentelor, acestea sunt deosebit de utile pentru compararea expresiei genelor a două țesuturi diferite, cum ar fi un țesut sănătos și canceros. De asemenea, se poate măsura ce gene sunt exprimate și cum se schimbă această expresie în timp sau cu alți factori. Există multe moduri diferite de a fabrica micromatrice; cele mai comune sunt cipurile de siliciu, lamele de microscop cu pete de ~100 de micrometri diametru, matricele personalizate și matricele cu pete mai mari pe membrane poroase (macroarrays). Pot exista oriunde de la 100 de puncte la mai mult de 10.000 pe o anumită matrice. Arrayurile pot fi realizate și cu alte molecule decât ADN.

Oligonucleotidă specifică alelei

Oligonucleotid alele-specific (ASO) este o tehnică care permite detectarea mutațiilor cu o singură bază fără a fi nevoie de PCR sau electroforeză pe gel. Sondele scurte (20-25 de nucleotide lungime), marcate sunt expuse la ADN-ul țintă nefragmentat, hibridizarea are loc cu specificitate ridicată datorită lungimii scurte a sondelor și chiar și o singură schimbare a bazei va împiedica hibridizarea. ADN-ul țintă este apoi spălat și sondele marcate care nu s-au hibridizat sunt îndepărtate. ADN-ul țintă este apoi analizat pentru prezența sondei prin radioactivitate sau fluorescență. În acest experiment, ca și în majoritatea tehnicilor de biologie moleculară, trebuie utilizat un control pentru a asigura o experimentare de succes.

În biologia moleculară, procedurile și tehnologiile sunt în continuă dezvoltare, iar tehnologiile mai vechi sunt abandonate. De exemplu, înainte de apariția electroforezei pe gel ADN ( agaroză sau poliacrilamidă ), dimensiunea moleculelor de ADN a fost determinată în mod obișnuit de viteza de sedimentare în gradienți de zaharoză, o tehnică lentă și care necesită multă muncă, care necesită instrumentare costisitoare; înainte de gradienții de zaharoză, s- a folosit vâscometrie . Pe lângă interesul lor istoric, de multe ori merită să știți despre tehnologia mai veche, deoarece ocazional este util să rezolvați o altă problemă nouă pentru care tehnica mai nouă este inadecvată.

Vezi si

Referințe

Lectură în continuare

linkuri externe