Молекулярная биология -Molecular biology

Из Википедии, бесплатной энциклопедии

Молекулярная биология / m ə ˈ l ɛ k j ʊ l ər / - это раздел биологии, который стремится понять молекулярную основу биологической активности внутри и между клетками, включая молекулярный синтез, модификацию, механизмы и взаимодействия. Изучение химической и физической структуры биологических макромолекул известно как молекулярная биология.

Молекулярная биология впервые была описана как подход, ориентированный на изучение основ биологических явлений — раскрытие структур биологических молекул, а также их взаимодействий и того, как эти взаимодействия объясняют наблюдения классической биологии.

В 1945 году физик Уильям Эстбери использовал термин «молекулярная биология». Развитие в области молекулярной биологии произошло очень поздно, чтобы понять, что сложная система или выгодный подход будут сделаны простым способом понимания с использованием бактерий и бактериофагов, этот организм дает информацию об основных биологических процессах с большей готовностью, чем животная клетка. В 1953 году два молодых человека по имени Фрэнсис Крик и Джеймс Уотсон, работавшие в подразделении Совета медицинских исследований Кавендишской лаборатории в Кембридже (ныне Лаборатория молекулярной биологии MRC ), создали модель двойной спирали ДНК, которая полностью изменила предложенный ими сценарий исследования ДНК. структура, основанная на предыдущих исследованиях, проведенных Розалиндой Франклин и Морисом Уилкинсом, затем исследования привели к обнаружению материала ДНК в других микроорганизмах, растениях и животных.

Молекулярная биология — это не просто изучение биологических молекул и их взаимодействий; скорее, это также набор методов, разработанных с момента возникновения области, которые позволили ученым узнать о молекулярных процессах. Одним из известных методов, который произвел революцию в этой области, является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая была разработана в 1983 году. ПЦР — это реакция, которая амплифицирует небольшие количества ДНК, и она используется во многих приложениях в различных научных дисциплинах, как будет обсуждаться позже. .

Центральная догма молекулярной биологии описывает процесс, при котором ДНК транскрибируется в РНК, которая затем транслируется в белок.

Молекулярная биология также играет решающую роль в понимании структур, функций и внутреннего контроля в отдельных клетках, и все это можно использовать для эффективного нацеливания новых лекарств, диагностики заболеваний и лучшего понимания клеточной физиологии. Некоторые клинические исследования и медицинские методы лечения, основанные на молекулярной биологии, охватываются генной терапией, тогда как использование молекулярной биологии или молекулярно-клеточной биологии в медицине теперь называется молекулярной медициной .

История молекулярной биологии

Молекулярная биология находится на пересечении биохимии и генетики; по мере возникновения и развития этих научных дисциплин в 20 веке стало ясно, что обе они стремились определить молекулярные механизмы, лежащие в основе жизненно важных клеточных функций. Успехи молекулярной биологии тесно связаны с разработкой новых технологий и их оптимизацией. Молекулярная биология была прояснена благодаря работам многих ученых, и, таким образом, история этой области зависит от понимания этих ученых и их экспериментов.

Все начинается с явления трансформации у бактерий, в 1928 году Фредерик Гриффит наблюдал явление трансформации одной бактерии в другую [теперь известное как генетическая трансформация]. В то время он не мог объяснить феномен трансформации. Позднее, в 1944 году, трое ученых Освальд Эйвери, Колин Маклеод и Маклин Маккарти продемонстрировали весь феномен трансформации бактерий. Через два года в 1930 году молекулярная биология стала официальной отраслью науки. Но термин «молекулярная биология» не был придуман до 1938 года, и это сделал ученый Уоррен Уивер, который работал директором отдела естественных наук в Фонде Рокфеллера.

Из следующего эксперимента был сделан вывод, что ДНК является основным генетическим материалом, вызвавшим генетические изменения. Основной состав ДНК был известен тем, что он содержит четыре основания, известные как – аденин, гуанин, тимин и цитозин. Так, на основании химического состава и рентгеноструктурного анализа, проведенного Морисом Уилкинсом и Розалинд Франклин, структура ДНК была предложена Джеймсом Уотсоном и Фрэнсисом Криком. Но до того, как Уотсон и Крик предложили структуру ДНК, в 1950 году австрийский ученый Эрвин Чаргафф предложил теорию/правило [известное сегодня как правило Чаргаффа], согласно которому количества аденина и тимина, гуанина и цитозина равны. пропорция.

Правило Чаргаффа

«Правило Чаргаффа гласило, что ДНК любого вида любого организма должна иметь стехиометрическое соотношение пуринов и пиримидинов 1:1 (т. е. A+G=T+C) и, более конкретно, количество гуанина должно быть равно количеству цитозина . а количество аденина должно быть равно тимину . Эта закономерность обнаруживается в обеих цепях ДНК».

Область генетики возникла как попытка понять молекулярные механизмы генетической наследственности и структуру гена . Грегор Мендель начал эту работу в 1866 году, когда он впервые написал законы генетической наследственности на основе своих исследований скрещивания растений гороха. Одним из таких законов генетической наследственности является закон сегрегации, который гласит, что диплоидные особи с двумя аллелями определенного гена передают один из этих аллелей своему потомству. Из-за его критической работы изучение генетической наследственности обычно называют менделевской генетикой .

Важной вехой в молекулярной биологии стало открытие структуры ДНК. Эта работа была начата в 1869 году Фридрихом Мишером, швейцарским биохимиком, который впервые предложил структуру, названную нуклеином, которая, как мы теперь знаем, представляет собой дезоксирибонуклеиновую кислоту или ДНК. Он открыл это уникальное вещество, изучая компоненты гнойных повязок и отмечая уникальные свойства «фосфорсодержащих веществ». Другим заметным вкладчиком в модель ДНК был Фебус Левен, который предложил «полинуклеотидную модель» ДНК в 1919 году в результате своих биохимических экспериментов на дрожжах. В 1950 году Эрвин Чаргафф расширил работу Левена и разъяснил несколько важнейших свойств нуклеиновых кислот: во-первых, последовательность нуклеиновых кислот различается у разных видов. Во-вторых, общая концентрация пуринов (аденина и гуанина) всегда равна общей концентрации пиримидинов (цистеина и тимина). Теперь это известно как правило Чаргаффа. В 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик опубликовали двойную спиральную структуру ДНК, используя работу по рентгеновской кристаллографии, проведенную Розалиндой Франклин и Морисом Уилкинсом . Уотсон и Крик описали структуру ДНК и высказали предположение о значении этой уникальной структуры для возможных механизмов репликации ДНК.

Дж. Д. Уотсон и Ф. Х. Крик были удостоены Нобелевской премии в 1962 году вместе с Морисом Уилкенсом за предложение модели структуры ДНК.

Со временем в 1964 г. К.А.Маркер и Фредерик Сэнгер открыли у E.coli особую амиоацил-тРНК, названную N-формилметионил-тРНК, и объяснили, что эта молекула играет роль в особом механизме удлинения цепи. Он был удостоен второй Нобелевской премии за открытие полной последовательности из 5400 нуклеотидов одноцепочечной ДНК бактериофагов F ´ 174.

В 1961 году было продемонстрировано, что когда ген кодирует белок, три последовательных основания ДНК гена определяют каждую последующую аминокислоту белка. Таким образом, генетический код представляет собой триплетный код, где каждый триплет (называемый кодоном) определяет определенную аминокислоту. Кроме того, было показано, что кодоны не перекрываются друг с другом в последовательности ДНК, кодирующей белок, и что каждая последовательность считывается с фиксированной начальной точки.

В 1962–1964 годах благодаря использованию условно-летальных мутантов бактериального вируса были достигнуты фундаментальные успехи в нашем понимании функций и взаимодействий белков, используемых в механизмах репликации ДНК, репарации ДНК, рекомбинации ДНК и в сборке ДНК. молекулярных структур.

Схематическое изображение структуры ДНК Уотсона и Крика.
Описание угла в структуре ДНК

Эксперимент Ф. Гриффита

Схематическое изображение эксперимента

В 1928 году Фредерик Гриффит обнаружил свойство вирулентности у бактерий пневмококка, которые убивали лабораторных крыс. Согласно Менделю, распространенный в то время перенос генов мог происходить только от родительских клеток только к дочерним. Гриффит выдвинул другую теорию, заявив, что перенос генов, происходящий у представителей одного поколения, известен как горизонтальный перенос генов (HGT). Это явление теперь называют генетической трансформацией.

Гриффит обратился к бактериям Streptococcus pneumoniae, у которых было два разных штамма: один вирулентный и гладкий, а другой авирулентный и шероховатый. Гладкий штамм имел блестящий вид из-за присутствия типа специфического полисахарида – полимера капсулы глюкозы и глюкуроновой кислоты. Из-за этого полисахаридного слоя бактерий иммунная система хозяина не может распознать бактерии и убивает хозяина. Другой, авирулентный, шероховатый штамм лишен этой полисахаридной капсулы и имеет тусклый, шероховатый вид.

Наличие или отсутствие капсулы у штамма, как известно, определяется генетически. Гладкие и грубые деформации встречаются в нескольких различных типах, таких как SI, S-II, S-III и т. д. и RI, R-II, R-III и т. д. соответственно. Все эти подтипы бактерий S и R отличаются друг от друга типом антигена, который они продуцируют.

Эксперимент Херши и Чейза

Эксперимент Херши и Чейза

Подтверждение того, что ДНК является генетическим материалом, вызывающим инфекцию, пришло из эксперимента Херши и Чейза. Они использовали E.coli и бактериофаг для эксперимента. Этот эксперимент также известен как эксперимент с блендером, поскольку кухонный блендер использовался в качестве основного устройства. Альфред Херши и Марта Чейз продемонстрировали, что ДНК, введенная частицей фага в бактерию, содержит всю информацию, необходимую для синтеза дочерних частиц фага. Они использовали радиоактивность, чтобы пометить белковую оболочку бактериофага радиоактивной серой и ДНК радиоактивным фосфором в двух разных пробирках соответственно. После смешивания бактериофага и E.coli в пробирке начинается инкубационный период, в течение которого фаг трансформирует генетический материал в клетках E.coli . Затем смесь смешивают или взбалтывают, что отделяет фаг от клеток E.coli . Всю смесь центрифугируют, проверяют осадок, содержащий клетки E.coli, и отбрасывают надосадочную жидкость. В клетках E.coli обнаружен радиоактивный фосфор, что указывает на то, что трансформированный материал представляет собой ДНК, а не белковую оболочку.

Трансформированная ДНК присоединяется к ДНК E.coli, и радиоактивность наблюдается только на ДНК бактериофага. Эта мутировавшая ДНК может быть передана следующему поколению, и появилась теория трансдукции. Трансдукция — это процесс, при котором бактериальная ДНК переносит фрагмент бактериофага и передает его следующему поколению. Это также тип горизонтального переноса генов.

Современная молекулярная биология

По мере приближения к середине 20-х годов молекулярная биология вступает в золотой век, определяемый как вертикальным, так и горизонтальным техническим развитием. Вертикально новые технологии позволяют отслеживать биологические процессы в режиме реального времени на атомном уровне. Молекулярные биологи сегодня имеют доступ ко все более доступным данным секвенирования на все более высоких глубинах, что облегчает разработку новых методов генетических манипуляций в новых немодельных организмах. Точно так же синтетические молекулярные биологи будут стимулировать промышленное производство малых и макромолекул путем введения экзогенных метаболических путей в различные прокариотические и эукариотические клеточные линии.

В горизонтальном плане данные секвенирования становятся более доступными и используются во многих различных научных областях. Это будет способствовать развитию промышленности в развивающихся странах и повысит доступность для отдельных исследователей. Точно так же эксперименты по редактированию генов CRISPR-Cas9 теперь могут быть задуманы и реализованы отдельными людьми менее чем за 10 000 долларов США в новых организмах, что будет способствовать развитию промышленных и медицинских приложений.

Связь с другими биологическими науками

Схематическая связь между биохимией, генетикой и молекулярной биологией

В следующем списке описывается точка зрения на междисциплинарные отношения между молекулярной биологией и другими смежными областями.

В то время как исследователи применяют методы, специфичные для молекулярной биологии, обычно они сочетаются с методами генетики и биохимии . Большая часть молекулярной биологии является количественной, и в последнее время значительный объем работы был проделан с использованием методов информатики, таких как биоинформатика и вычислительная биология . Молекулярная генетика, изучение структуры и функций генов, с начала 2000-х годов была одной из самых выдающихся областей молекулярной биологии. Другие разделы биологии опираются на молекулярную биологию либо путем непосредственного изучения взаимодействий молекул как таковых, например, в клеточной биологии и биологии развития, либо косвенно, когда молекулярные методы используются для вывода об исторических атрибутах популяций или видов, как в области эволюционной биологии, такие как популяционная генетика и филогенетика . Существует также давняя традиция изучения биомолекул «с нуля» или на молекулярном уровне в биофизике .

Методы молекулярной биологии

ДНК анимация

Молекулярное клонирование

Изображение трансдукции

Молекулярное клонирование используется для выделения и последующего переноса интересующей последовательности ДНК в плазмидный вектор. Эта технология рекомбинантной ДНК была впервые разработана в 1960-х годах. В этом методе последовательность ДНК, кодирующая интересующий белок, клонируется с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или рестрикционных ферментов в плазмиду ( вектор экспрессии ). Плазмидный вектор обычно имеет как минимум 3 отличительных признака: точку начала репликации, сайт множественного клонирования (MCS) и селективный маркер (обычно резистентность к антибиотикам ). Кроме того, выше MCS находятся промоторные области и сайт начала транскрипции, которые регулируют экспрессию клонированного гена.

Эта плазмида может быть встроена как в бактериальные клетки, так и в клетки животных. Введение ДНК в бактериальные клетки может быть осуществлено путем трансформации путем захвата «голой» ДНК, конъюгации посредством межклеточного контакта или путем трансдукции с помощью вирусного вектора. Введение ДНК в эукариотические клетки, такие как клетки животных, физическими или химическими средствами называется трансфекцией . Доступны несколько различных методов трансфекции, таких как трансфекция фосфатом кальция, электропорация, микроинъекция и липосомная трансфекция . Плазмида может быть интегрирована в геном, что приводит к стабильной трансфекции, или может оставаться независимой от генома и временно экспрессироваться, что называется транзиторной трансфекцией.

ДНК, кодирующая интересующий белок, теперь находится внутри клетки, и теперь этот белок может быть экспрессирован. Доступны различные системы, такие как индуцибельные промоторы и специфические клеточные сигнальные факторы, помогающие экспрессировать интересующий белок на высоких уровнях. Затем из бактериальной или эукариотической клетки можно извлечь большие количества белка. Белок можно проверить на ферментативную активность в различных ситуациях, белок можно кристаллизовать, чтобы изучить его третичную структуру, или, в фармацевтической промышленности, можно изучить активность новых лекарств против белка.

Полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — чрезвычайно универсальный метод копирования ДНК. Короче говоря, ПЦР позволяет копировать или модифицировать определенную последовательность ДНК заранее определенным образом. Реакция чрезвычайно мощная, и в идеальных условиях одна молекула ДНК может превратиться в 1,07 миллиарда молекул менее чем за два часа. ПЦР имеет множество применений, включая изучение экспрессии генов, обнаружение патогенных микроорганизмов, обнаружение генетических мутаций и введение мутаций в ДНК. Метод ПЦР можно использовать для введения сайтов рестрикционных ферментов на концах молекул ДНК или для мутации определенных оснований ДНК, последний метод называется сайт-направленным мутагенезом . ПЦР также можно использовать для определения того, находится ли конкретный фрагмент ДНК в библиотеке кДНК . ПЦР имеет множество вариаций, таких как ПЦР с обратной транскрипцией ( ОТ-ПЦР ) для амплификации РНК и, в последнее время, количественная ПЦР, которая позволяет количественно измерять молекулы ДНК или РНК.

Двухпроцентный агарозный гель в боратном буфере заливают в лоток для геля.

Гель-электрофорез

SDS-СТРАНИЦА

Гель-электрофорез — это метод разделения молекул по их размеру с использованием агарозного или полиакриламидного геля. Этот метод является одним из основных инструментов молекулярной биологии. Основной принцип заключается в том, что фрагменты ДНК можно разделить, пропуская через гель электрический ток. Поскольку остов ДНК содержит отрицательно заряженные фосфатные группы, ДНК будет мигрировать через агарозный гель к положительному концу тока. Белки также можно разделить по размеру с помощью геля SDS-PAGE или по размеру и их электрическому заряду с помощью так называемого двумерного гель-электрофореза .

Белки, окрашенные на геле PAGE с использованием красителя кумасси синего.

Анализ Брэдфорда

Анализ Брэдфорда — это метод молекулярной биологии, который позволяет быстро и точно определять количество белковых молекул с использованием уникальных свойств красителя Кумасси бриллиантового синего G-250. Coomassie Blue претерпевает видимое изменение цвета от красновато-коричневого до ярко-синего при связывании с белком. В своем нестабильном катионном состоянии кумасси синий имеет фоновую длину волны 465 нм и дает красновато-коричневый цвет. Когда Coomassie Blue связывается с белком в кислом растворе, фоновая длина волны смещается до 595 нм, и краситель окрашивается в ярко-синий цвет. Белки в анализе связывают кумасси синий примерно через 2 минуты, а комплекс белок-краситель стабилен в течение примерно часа, хотя рекомендуется измерять абсорбцию в течение 5–20 минут после начала реакции. Затем концентрацию белка в анализе Брэдфорда можно измерить с помощью спектрофотометра видимого света, и, следовательно, не требуется сложного оборудования.

Этот метод был разработан в 1975 г. Мэрион М. Брэдфорд и позволил значительно ускорить и повысить точность количественного определения белка по сравнению с предыдущими методами: процедурой Лоури и биуретовым анализом. В отличие от предыдущих методов анализ Брэдфорда не подвержен влиянию нескольких небелковых молекул, включая этанол, хлорид натрия и хлорид магния. Однако он чувствителен к воздействию сильных щелочных буферных агентов, таких как додецилсульфат натрия (SDS).

Макромолекулярный блоттинг и зондирование

Термины нозерн, вестерн и восточный блоттинг произошли от того, что изначально было шуткой молекулярной биологии, которая сыграла с термином Саузерн-блоттинг, после метода, описанного Эдвином Саузерн для гибридизации блотированной ДНК. Патрисия Томас, разработчик РНК-блота, который впоследствии стал известен как северный блот, на самом деле не использовала этот термин.

Саузерн-блоттинг

Саузерн-блоттинг, названный в честь его изобретателя, биолога Эдвина Саузерна, представляет собой метод исследования наличия определенной последовательности ДНК в образце ДНК. Образцы ДНК до или после расщепления ферментами рестрикции (эндонуклеазами рестрикции) разделяют с помощью гель-электрофореза, а затем переносят на мембрану путем блоттинга за счет капиллярного действия . Затем мембрану подвергают воздействию меченого ДНК-зонда, который имеет последовательность оснований, комплементарную последовательности интересующей ДНК. Саузерн-блоттинг реже используется в лабораторных исследованиях из-за способности других методов, таких как ПЦР, обнаруживать определенные последовательности ДНК из образцов ДНК. Однако эти блоты все еще используются для некоторых приложений, таких как измерение количества копий трансгена у трансгенных мышей или при разработке линий эмбриональных стволовых клеток с нокаутом гена .

Нозерн-блоттинг

Диаграмма нозерн-блоттинга

Нозерн - блоттинг используется для изучения присутствия специфических молекул РНК в качестве относительного сравнения набора различных образцов РНК. По сути, это комбинация гель-электрофореза денатурирующей РНК и блоттинга . В этом процессе РНК разделяют по размеру, а затем переносят на мембрану, которая затем исследуется меченым комплементом интересующей последовательности. Результаты можно визуализировать различными способами в зависимости от используемой метки; однако большинство из них приводит к выявлению полос, представляющих размеры РНК, обнаруженной в образце. Интенсивность этих полос связана с количеством РНК-мишени в анализируемых образцах. Процедура обычно используется для изучения того, когда и в какой степени происходит экспрессия генов, путем измерения того, сколько этой РНК присутствует в разных образцах, при условии, что не происходит посттранскрипционной регуляции и что уровни мРНК отражают пропорциональные уровни соответствующего белка. произведено. Это один из самых основных инструментов для определения того, в какое время и при каких условиях определенные гены экспрессируются в живых тканях.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг — это метод, с помощью которого можно обнаружить определенные белки из смеси белков. Вестерн-блоты можно использовать для определения размера выделенных белков, а также для количественной оценки их экспрессии. При вестерн-блоттинге белки сначала разделяют по размеру в тонком геле, помещенном между двумя стеклянными пластинами, с помощью метода, известного как SDS-PAGE . Белки в геле затем переносятся на поливинилиденфторид (ПВДФ), нитроцеллюлозу, нейлон или другую поддерживающую мембрану. Затем эту мембрану можно исследовать растворами антител . Затем антитела, которые специфически связываются с интересующим белком, можно визуализировать с помощью различных методов, включая окрашенные продукты, хемилюминесценцию или авторадиографию . Часто антитела метят ферментами. Когда хемилюминесцентный субстрат подвергается воздействию фермента, это позволяет обнаружить его. Использование методов вестерн-блоттинга позволяет не только обнаруживать, но и проводить количественный анализ. Методы, аналогичные вестерн-блоттингу, можно использовать для непосредственного окрашивания специфических белков в живых клетках или срезах тканей .

Восточный блоттинг

Метод восточного блоттинга используется для обнаружения посттрансляционной модификации белков. Белки, нанесенные на мембрану из ПВДФ или нитроцеллюлозы, исследуются на наличие модификаций с использованием конкретных субстратов.

Микрочипы

Распечатывается ДНК-микрочип
Гибридизация мишени с зондом

ДНК-микрочип представляет собой набор пятен, прикрепленных к твердой подложке, такой как предметное стекло микроскопа, где каждое пятно содержит один или несколько фрагментов одноцепочечных олигонуклеотидов ДНК. Массивы позволяют наносить большое количество очень маленьких (диаметром 100 микрометров) пятен на одно предметное стекло. Каждое пятно имеет молекулу фрагмента ДНК, комплементарную одной последовательности ДНК . Вариант этого метода позволяет квалифицировать экспрессию генов организма на определенной стадии развития ( профилирование экспрессии ). В этом методе РНК в ткани выделяют и превращают в меченую комплементарную ДНК (кДНК). Эта кДНК затем гибридизуется с фрагментами на матрице, и может быть выполнена визуализация гибридизации. Поскольку можно сделать несколько массивов с точно таким же положением фрагментов, они особенно полезны для сравнения экспрессии генов двух разных тканей, таких как здоровая и раковая ткань. Кроме того, можно измерить, какие гены экспрессируются и как эта экспрессия меняется со временем или с другими факторами. Существует множество различных способов изготовления микрочипов; наиболее распространенными являются кремниевые чипы, предметные стекла микроскопа с пятнами диаметром ~ 100 микрометров, специальные матрицы и матрицы с более крупными пятнами на пористых мембранах (макроматрицы). На данном массиве может быть от 100 до более 10 000 точек. Массивы также могут быть сделаны с молекулами, отличными от ДНК.

Аллель-специфический олигонуклеотид

Аллель-специфический олигонуклеотид (ASO) — это метод, который позволяет обнаруживать мутации с одним основанием без необходимости проведения ПЦР или гель-электрофореза. Короткие (длиной 20–25 нуклеотидов) меченые зонды подвергаются воздействию нефрагментированной ДНК-мишени, гибридизация происходит с высокой специфичностью из-за короткой длины зондов, и даже одно изменение основания будет препятствовать гибридизации. Затем ДНК-мишень промывают и удаляют меченые зонды, которые не гибридизировались. Затем ДНК-мишень анализируют на наличие зонда с помощью радиоактивности или флуоресценции. В этом эксперименте, как и в большинстве методов молекулярной биологии, необходимо использовать контроль для обеспечения успеха эксперимента.

В молекулярной биологии процедуры и технологии постоянно развиваются, а от старых технологий отказываются. Например, до появления гель-электрофореза ДНК ( агарозный или полиакриламидный ) размер молекул ДНК обычно определяли по скорости седиментации в градиентах сахарозы — медленный и трудоемкий метод, требующий дорогостоящего оборудования; перед градиентами сахарозы использовали вискозиметрию . Помимо их исторического интереса, часто стоит знать о старых технологиях, поскольку иногда бывает полезно решить другую новую проблему, для которой более новая техника не подходит.

Смотрите также

использованная литература

дальнейшее чтение

внешние ссылки