Moleküler Biyoloji -Molecular biology

Vikipedi, özgür ansiklopedi

Moleküler biyoloji / m ə l ɛ k j ʊ l ər / moleküler sentez, modifikasyon, mekanizmalar ve etkileşimler dahil olmak üzere hücrelerdeki ve hücreler arasındaki biyolojik aktivitenin moleküler temelini anlamaya çalışan biyoloji dalıdır . Biyolojik makromoleküllerin kimyasal ve fiziksel yapısının incelenmesi moleküler biyoloji olarak bilinir.

Moleküler biyoloji ilk olarak biyolojik olayların temellerine odaklanan bir yaklaşım olarak tanımlandı - biyolojik moleküllerin yapılarının yanı sıra etkileşimlerini ve bu etkileşimlerin klasik biyoloji gözlemlerini nasıl açıkladığını ortaya çıkardı.

1945'te moleküler biyoloji terimi fizikçi William Astbury tarafından kullanıldı. Moleküler biyoloji alanındaki gelişmeler, bakteri ve bakteriyofajlar kullanılarak karmaşık sistemin veya avantajlı yaklaşımın basit bir şekilde anlaşılabileceğinin anlaşılması açısından çok geç olmuştur. Bu organizma, temel biyolojik süreçler hakkında hayvan hücresinden daha kolay bilgi verir. 1953'te, Cambridge'deki Cavendish Laboratuvarı'ndaki (şimdi MRC Moleküler Biyoloji Laboratuvarı ) Tıbbi Araştırma Konseyi biriminde çalışan Francis Crick ve James Watson adında iki genç adam, DNA'nın çift sarmallı bir modelini yaptılar ve bu da tüm araştırma senaryosunu değiştiren DNA'yı önerdiler. Rosalind Franklin ve Maurice Wilkins tarafından yapılan önceki araştırmalara dayanan yapı, daha sonra araştırma, diğer mikroorganizmalarda, bitkilerde ve hayvanlarda DNA materyali bulmaya yol açar.

Moleküler biyoloji, sadece biyolojik moleküllerin ve bunların etkileşimlerinin incelenmesi değildir; daha ziyade, bilim adamlarının moleküler süreçler hakkında bilgi edinmelerini sağlayan, alanın doğuşundan bu yana geliştirilen tekniklerin bir koleksiyonudur. Bu alanda devrim yaratan dikkate değer bir teknik, 1983 yılında geliştirilen polimeraz zincir reaksiyonudur (PCR). PCR, küçük miktarlarda DNA'yı çoğaltan bir reaksiyondur ve daha sonra tartışılacağı gibi, bilimsel disiplinlerde birçok uygulamada kullanılmaktadır. .

Moleküler biyolojinin merkezi dogması, DNA'nın RNA'ya kopyalandığı ve daha sonra proteine ​​dönüştürüldüğü süreci tanımlar.

Moleküler biyoloji ayrıca tek tek hücrelerdeki yapıların, işlevlerin ve iç kontrollerin anlaşılmasında kritik bir rol oynar ve bunların tümü yeni ilaçları verimli bir şekilde hedeflemek, hastalıkları teşhis etmek ve hücre fizyolojisini daha iyi anlamak için kullanılabilir. Moleküler biyolojiden kaynaklanan bazı klinik araştırmalar ve tıbbi tedaviler gen terapisi kapsamındayken, moleküler biyoloji veya moleküler hücre biyolojisinin tıpta kullanımı artık moleküler tıp olarak adlandırılmaktadır .

Moleküler biyolojinin tarihi

Moleküler biyoloji, biyokimya ve genetiğin kesiştiği noktada yer alır; 20. yüzyılda bu bilimsel disiplinler ortaya çıktıkça ve geliştikçe, her ikisinin de hayati hücresel fonksiyonların altında yatan moleküler mekanizmaları belirlemeye çalıştıkları ortaya çıktı. Moleküler biyolojideki ilerlemeler, yeni teknolojilerin geliştirilmesi ve bunların optimizasyonu ile yakından ilişkilidir. Moleküler biyoloji, birçok bilim insanının çalışmalarıyla aydınlatılmıştır ve bu nedenle alanın tarihi, bu bilim adamlarının ve deneylerinin anlaşılmasına bağlıdır.

Her şey bakterideki transformasyon fenomeni ile başlar, 1928'de Frederick Griffith, bir bakteriden diğerine [şimdi genetik transformasyon olarak bilinen] bir transformasyon fenomenini gözlemledi. O zaman, dönüşüm olgusunu açıklayamıyordu. Daha sonra 1944'te, üç bilim adamı Oswald Avery, Colin Macleod ve Maclyn McCarty, bakterilerdeki tüm dönüşüm fenomenini gösterdi. İki yıl sonra 1930'da moleküler biyoloji resmi bir bilim dalı olarak kuruldu. Ancak “Moleküler Biyoloji” terimi 1938 yılına kadar ortaya çıkmamıştı ve bu, Rockefeller Vakfı'nda Doğa Bilimleri direktörü olarak çalışan bilim adamı Warren Weaver tarafından yapıldı.

Aşağıdaki deneyden, DNA'nın genetik değişikliklere neden olan temel genetik materyal olduğu sonucuna varıldı. DNA'nın temel bileşimi, Adenin, Guanin, Timin ve Sitozin olarak bilinen dört baz içerdiği biliniyordu. Böylece, Maurice Wilkins ve Rosalind Franklin tarafından yapılan kimyasal bileşim ve X-ışını kristalografisi temelinde, DNA yapısı James Watson ve Francis Crick tarafından önerildi. Fakat Watson ve Crick DNA yapısını önermeden önce, 1950'de Avusturya doğumlu bilim adamı Erwin Chargaff, Adenin ve Timin ve Guanin ve Sitozin sayısının eşit olduğunu belirten teori/kural [bugün Chargaff kuralı olarak bilinir] önerdi. oran.

Chargaff'ın kuralı

"Chargaff'ın kuralı, herhangi bir organizmanın herhangi bir türünden elde edilen DNA'nın 1:1 stoikiometrik pürin ve pirimidin oranına (yani, A+G=T+C) sahip olması gerektiğini ve daha spesifik olarak, guanin miktarının sitozine eşit olması gerektiğini belirtti. ve adenin miktarı timine eşit olmalıdır . Bu model DNA'nın her iki zincirinde de bulunur".

Genetik alanı, genetik kalıtımın moleküler mekanizmalarını ve bir genin yapısını anlama girişimi olarak ortaya çıktı . Gregor Mendel, 1866'da bezelye bitkilerinde çiftleşme haçları çalışmalarına dayanarak genetik kalıtım yasalarını ilk yazdığında bu çalışmaya öncülük etti. Böyle bir genetik kalıtım yasası, belirli bir gen için iki alele sahip diploid bireylerin bu alellerden birini yavrularına geçireceğini belirten ayrılma yasasıdır . Eleştirel çalışması nedeniyle, genetik kalıtım çalışmasına genellikle Mendel genetiği denir .

Moleküler biyolojide önemli bir dönüm noktası, DNA'nın yapısının keşfiydi. Bu çalışma, 1869'da, şimdi deoksiribonükleik asit veya DNA olduğunu bildiğimiz nüklein adlı bir yapıyı ilk kez öneren İsviçreli bir biyokimyacı olan Friedrich Miescher tarafından başladı. Bu eşsiz maddeyi, irin dolgulu bandajların bileşenlerini inceleyerek ve "fosfor içeren maddelerin" benzersiz özelliklerini not ederek keşfetti. DNA modeline katkıda bulunan diğer bir kayda değer katkı ise 1919'da maya üzerinde yaptığı biyokimyasal deneyler sonucunda DNA'nın "polinükleotid modelini" öneren Phoebus Levene'dir . 1950'de Erwin Chargaff, Levene'nin çalışmalarını genişletti ve nükleik asitlerin birkaç kritik özelliğini açıkladı: ilk olarak, nükleik asitlerin dizisi türler arasında değişir. İkincisi, pürinlerin (adenin ve guanin) toplam konsantrasyonu her zaman pirimidinlerin (sistein ve timin) toplam konsantrasyonuna eşittir. Bu artık Chargaff kuralı olarak bilinir. 1953'te James Watson ve Francis Crick, Rosalind Franklin ve Maurice Wilkins tarafından yapılan X-ışını kristalografi çalışmasını kullanarak DNA'nın çift sarmal yapısını yayınladılar . Watson ve Crick, DNA'nın yapısını tanımladılar ve bu eşsiz yapının, DNA replikasyonunun olası mekanizmaları üzerindeki etkileri hakkında tahminde bulundular.

JD Watson ve FHC Crick, 1962'de Maurice Wilkens ile birlikte DNA yapısının bir modelini önerdikleri için Nobel ödülüne layık görüldüler.

Zaman geçtikçe, 1964 yılında KA Marker ve Frederick Sanger, E.coli'de N-formil-metiyonil – tRNA adı verilen özel bir amioaçil-tRNA keşfettiler ve bu molekülün zincir uzamasının özel mekanizmasında rol oynadığını açıkladılar. F' 174 bakteriyofajların tek zincirli DNA'sının 5.400 nükleotidinin tam dizisini keşfettiği için ikinci Nobel ödülüne layık görüldü.

1961'de, bir gen bir proteini kodladığında, bir genin DNA'sının üç ardışık bazının proteinin her bir ardışık amino asidini belirttiği gösterildi. Bu nedenle genetik kod, her üçlünün (kodon olarak adlandırılır) belirli bir amino asidi belirttiği bir üçlü koddur. Ayrıca bir proteini kodlayan DNA dizisinde kodonların birbiriyle örtüşmediği ve her dizinin sabit bir başlangıç ​​noktasından okunduğu gösterilmiştir.

1962-1964 yılları arasında, bir bakteriyel virüsün koşullu öldürücü mutantlarının kullanılması yoluyla, DNA replikasyonu, DNA onarımı, DNA rekombinasyonu ve düzenek makinelerinde kullanılan proteinlerin fonksiyonlarını ve etkileşimlerini anlamamızda temel ilerlemeler kaydedildi. moleküler yapılardan oluşur.

Watson ve Crick'in DNA yapısının şematik gösterimi
DNA yapısında açı açıklaması

F.Griffith deneyi

Deneyin şematik gösterimi

1928'de Fredrick Griffith, pnömokok bakterilerinde laboratuvar farelerini öldüren bir virülans özelliğiyle karşılaştı. O dönemde yaygın olan Mendel'e göre, gen aktarımı yalnızca ebeveynden yavru hücrelere gerçekleşebilirdi. Griffith, aynı neslin üyelerinde meydana gelen gen transferinin yatay gen transferi (HGT) olarak bilindiğini belirten başka bir teori geliştirdi. Bu fenomen şimdi genetik transformasyon olarak adlandırılır.

Griffith, biri virülent ve pürüzsüz, diğeri ise avirülent ve pürüzlü olmak üzere iki farklı suşu olan Streptococcus pneumoniae bakterisine değindi. Pürüzsüz suş, bir tür spesifik polisakarit - bir glikoz polimeri ve glukuronik asit kapsülü - varlığından dolayı parıldayan bir görünüme sahipti. Bu polisakkarit bakteri tabakası nedeniyle, bir konağın bağışıklık sistemi bakterileri tanıyamaz ve konağı öldürür. Diğer, avirülent, kaba suş, bu polisakkarit kapsülden yoksundur ve donuk, pürüzlü bir görünüme sahiptir.

Suşta kapsülün varlığının veya yokluğunun genetik olarak belirlendiği bilinmektedir. Düzgün ve kaba suşlar sırasıyla SI, S-II, S-III vb. ve RI, R-II, R-III vb. gibi birkaç farklı tipte meydana gelir. S ve R bakterilerinin tüm bu alt tipleri ürettikleri antijen tipinde birbirinden farklılık gösterir.

Hershey ve Chase deneyi

Hershey ve Chase deneyi

Hershey ve Chase deneyinden DNA'nın enfeksiyona neden olan genetik materyal olduğu doğrulandı. Deney için E.coli ve bakteriyofaj kullandılar . Bu deney aynı zamanda blender deneyi olarak da bilinir, çünkü mutfak blenderi büyük bir aparat parçası olarak kullanılmıştır. Alfred Hershey ve Martha Chase, bir faj partikülü tarafından bir bakteriye enjekte edilen DNA'nın, soy faj partiküllerini sentezlemek için gerekli tüm bilgileri içerdiğini gösterdi. Bakteriyofajın protein kaplamasını radyoaktif kükürt ve DNA'yı radyoaktif fosfor ile etiketlemek için radyoaktivite kullandılar, sırasıyla iki farklı test tüpüne. Bakteriyofaj ve E.coli'yi test tüpüne karıştırdıktan sonra, fajın E.coli hücrelerindeki genetik materyali dönüştürdüğü kuluçka dönemi başlar. Daha sonra karışım harmanlanır veya çalkalanır, bu da fajı E.coli hücrelerinden ayırır . Bütün karışım santrifüjlenir ve E.coli hücrelerini içeren pelet kontrol edilir ve süpernatant atılır. E.coli hücreleri, dönüştürülen materyalin protein kaplaması değil DNA olduğunu gösteren radyoaktif fosfor gösterdi .

Dönüştürülen DNA, E.coli'nin DNA'sına bağlanır ve radyoaktivite yalnızca bakteriyofajın DNA'sında görülür. Bu mutasyona uğramış DNA bir sonraki nesle aktarılabilir ve Transdüksiyon teorisi ortaya çıkmıştır. Transdüksiyon, bakteriyel DNA'nın bakteriyofaj fragmanını taşıdığı ve bir sonraki nesle aktardığı bir süreçtir. Bu aynı zamanda bir tür yatay gen transferidir.

Modern moleküler biyoloji

20'li yılların ortalarına yaklaşırken, moleküler biyoloji hem dikey hem de yatay teknik gelişme ile tanımlanan bir altın çağa giriyor. Dikey olarak, yeni teknolojiler biyolojik süreçlerin atomik düzeyde gerçek zamanlı izlenmesine izin veriyor. Günümüzde moleküler biyologlar, giderek daha yüksek derinliklerde giderek daha uygun fiyatlı dizileme verilerine erişerek, yeni model olmayan organizmalarda yeni genetik manipülasyon yöntemlerinin geliştirilmesini kolaylaştırmaktadır. Benzer şekilde, sentetik moleküler biyologlar, çeşitli prokaryotik ve ökaryotik hücre hatlarında eksojen metabolik yolların tanıtılması yoluyla küçük ve makro moleküllerin endüstriyel üretimini yönlendireceklerdir.

Yatay olarak, sıralama verileri daha uygun fiyatlı hale geliyor ve birçok farklı bilimsel alanda kullanılıyor. Bu, gelişmekte olan ülkelerdeki endüstrilerin gelişimini yönlendirecek ve bireysel araştırmacılara erişilebilirliği artıracaktır. Benzer şekilde, CRISPR-Cas9 gen düzenleme deneyleri artık bireyler tarafından 10.000 doların altında yeni organizmalarda tasarlanabilir ve uygulanabilir, bu da endüstriyel ve tıbbi uygulamaların gelişimini yönlendirecektir.

Diğer biyolojik bilimlerle ilişkisi

Biyokimya, genetik ve moleküler biyoloji arasındaki şematik ilişki

Aşağıdaki liste, moleküler biyoloji ve diğer ilgili alanlar arasındaki disiplinler arası ilişkilere ilişkin bir bakış açısını açıklamaktadır.

Araştırmacılar moleküler biyolojiye özgü teknikleri uygularken, bunları genetik ve biyokimyadan gelen yöntemlerle birleştirmek yaygındır . Moleküler biyolojinin çoğu niceldir ve son zamanlarda biyoinformatik ve hesaplamalı biyoloji gibi bilgisayar bilimi teknikleri kullanılarak önemli miktarda çalışma yapılmıştır . Moleküler genetik, gen yapısı ve fonksiyonunun incelenmesi, 2000'li yılların başından beri moleküler biyolojinin en belirgin alt alanları arasında yer almaktadır. Biyolojinin diğer dalları, moleküler biyoloji tarafından, ya hücre biyolojisi ve gelişim biyolojisi gibi kendi başlarına moleküllerin etkileşimlerini doğrudan inceleyerek ya da moleküler tekniklerin popülasyonların veya türlerin tarihsel özelliklerini çıkarmak için kullanıldığı dolaylı olarak bilgilendirilir . popülasyon genetiği ve filogenetik gibi evrimsel biyolojideki alanlar . Ayrıca biyofizikte biyomolekülleri "sıfırdan" veya moleküler olarak incelemek konusunda uzun bir gelenek vardır .

Moleküler biyoloji teknikleri

DNA animasyonu

moleküler klonlama

transdüksiyon resmi

Moleküler klonlama, ilgili bir DNA dizisini izole etmek ve ardından bir plazmit vektörüne aktarmak için kullanılır. Bu rekombinant DNA teknolojisi ilk olarak 1960'larda geliştirildi. Bu teknikte, ilgilenilen bir proteini kodlayan bir DNA dizisi, polimeraz zincir reaksiyonu ( PCR ) ve/veya kısıtlama enzimleri kullanılarak bir plazmide ( ifade vektörü ) klonlanır . Plazmit vektörü genellikle en az 3 ayırt edici özelliğe sahiptir: bir replikasyon orijini, bir çoklu klonlama bölgesi (MCS) ve bir seçici işaretleyici (genellikle antibiyotik direnci ). Ek olarak, MCS'nin yukarı akışı, klonlanmış genin ekspresyonunu düzenleyen promotör bölgeler ve transkripsiyon başlangıç ​​bölgesidir.

Bu plazmit, bakteri veya hayvan hücrelerine yerleştirilebilir. DNA'nın bakteri hücrelerine verilmesi, çıplak DNA'nın alınması yoluyla transformasyon, hücre-hücre teması yoluyla konjugasyon veya viral vektör yoluyla transdüksiyon yoluyla yapılabilir. DNA'nın hayvan hücreleri gibi ökaryotik hücrelere fiziksel veya kimyasal yollarla verilmesine transfeksiyon denir . Kalsiyum fosfat transfeksiyonu, elektroporasyon, mikroenjeksiyon ve lipozom transfeksiyonu gibi birkaç farklı transfeksiyon tekniği mevcuttur . Plazmit genoma entegre edilebilir ve stabil bir transfeksiyonla sonuçlanabilir veya genomdan bağımsız kalabilir ve geçici olarak eksprese edilebilir, buna geçici transfeksiyon denir.

İlgilenilen bir protein için DNA kodlaması artık bir hücrenin içindedir ve protein artık ifade edilebilir. İndüklenebilir promotörler ve spesifik hücre sinyal faktörleri gibi çeşitli sistemler, ilgilenilen proteini yüksek seviyelerde ifade etmeye yardımcı olmak için mevcuttur. Büyük miktarlarda bir protein daha sonra bakteriyel veya ökaryotik hücreden ekstrakte edilebilir. Protein, çeşitli durumlar altında enzimatik aktivite için test edilebilir, protein kristalize edilerek üçüncül yapısı incelenebilir veya farmasötik endüstrisinde proteine ​​karşı yeni ilaçların aktivitesi araştırılabilir.

Polimeraz zincirleme reaksiyonu

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), DNA'yı kopyalamak için çok yönlü bir tekniktir. Kısaca PCR, belirli bir DNA dizisinin önceden belirlenmiş yollarla kopyalanmasına veya değiştirilmesine izin verir. Reaksiyon son derece güçlüdür ve mükemmel koşullar altında bir DNA molekülünü iki saatten daha kısa bir sürede 1.07 milyar molekül haline getirebilir. PCR, gen ekspresyonu çalışması, patojenik mikroorganizmaların tespiti, genetik mutasyonların tespiti ve mutasyonların DNA'ya tanıtılması dahil olmak üzere birçok uygulamaya sahiptir. PCR tekniği, DNA moleküllerinin uçlarına restriksiyon enzim sitelerini sokmak veya belirli DNA bazlarını mutasyona uğratmak için kullanılabilir; ikincisi, bölgeye yönelik mutajenez olarak adlandırılan bir yöntemdir . PCR, belirli bir DNA parçasının bir cDNA kitaplığında bulunup bulunmadığını belirlemek için de kullanılabilir . PCR, RNA'nın amplifikasyonu için ters transkripsiyon PCR ( RT-PCR ) ve daha yakın zamanlarda, DNA veya RNA moleküllerinin nicel ölçümüne izin veren nicel PCR gibi birçok varyasyona sahiptir .

Bir jel tepsisine dökülen borat tamponunda yüzde iki agaroz jeli .

Jel elektroforezi

GBF-SAYFASI

Jel elektroforezi, bir agaroz veya poliakrilamid jel kullanarak molekülleri boyutlarına göre ayıran bir tekniktir. Bu teknik, moleküler biyolojinin başlıca araçlarından biridir. Temel prensip, DNA fragmanlarının jel boyunca bir elektrik akımı uygulanarak ayrılabilmesidir - DNA omurgası negatif yüklü fosfat grupları içerdiğinden, DNA, akımın pozitif ucuna doğru agaroz jeli boyunca göç edecektir. Proteinler ayrıca bir SDS-PAGE jel kullanılarak boyut bazında veya 2D jel elektroforezi olarak bilinen yöntem kullanılarak boyut ve elektrik yükleri temelinde ayrılabilir .

Coomassie mavi boyası kullanılarak bir PAGE jeli üzerinde boyanmış proteinler.

Bradford Testi

Bradford Testi, Coomassie Brilliant Blue G-250 adı verilen bir boyanın benzersiz özelliklerini kullanarak protein moleküllerinin hızlı ve doğru nicelenmesini sağlayan bir moleküler biyoloji tekniğidir . Coomassie Blue, proteine ​​bağlandığında kırmızımsı kahverengiden parlak maviye görünür bir renk kaymasına uğrar. Kararsız, katyonik durumunda Coomassie Blue, 465 nm'lik bir arka plan dalga boyuna sahiptir ve kırmızımsı-kahverengi bir renk verir. Coomassie Blue, asidik bir çözeltide proteine ​​bağlandığında, arka plan dalga boyu 595 nm'ye kayar ve boya, parlak mavi bir renk verir. Testteki proteinler Coomassie mavisini yaklaşık 2 dakika içinde bağlar ve protein-boya kompleksi yaklaşık bir saat stabildir, ancak absorbans okumalarının reaksiyon başlangıcından sonraki 5 ila 20 dakika içinde alınması tavsiye edilir. Bradford tahlilindeki protein konsantrasyonu daha sonra bir görünür ışık spektrofotometresi kullanılarak ölçülebilir ve bu nedenle kapsamlı ekipman gerektirmez.

Bu yöntem 1975'te Marion M. Bradford tarafından geliştirildi ve önceki yöntemlere kıyasla önemli ölçüde daha hızlı, daha doğru protein miktar tayini sağladı: Lowry prosedürü ve biüret tahlili. Önceki yöntemlerden farklı olarak, Bradford tahlili etanol, sodyum klorür ve magnezyum klorür dahil olmak üzere birkaç protein olmayan molekülün etkileşimine duyarlı değildir. Bununla birlikte, sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi güçlü alkali tamponlama maddelerinin etkisine karşı hassastır .

Makromolekül lekeleme ve sondalama

Kuzey, batı ve doğu lekeleme terimleri, Edwin Southern tarafından lekelenmiş DNA'nın hibridizasyonu için tarif edilen teknikten sonra, Southern lekeleme terimi üzerinde oynanan bir moleküler biyoloji şakasından türetilmiştir . Daha sonra kuzey lekesi olarak bilinen RNA lekesinin geliştiricisi Patricia Thomas aslında bu terimi kullanmadı.

Güney lekelenmesi

Adını mucidi biyolog Edwin Southern'den alan Southern blot, bir DNA numunesi içinde belirli bir DNA dizisinin varlığını araştırmak için kullanılan bir yöntemdir. Kısıtlama enzimi (kısıtlama endonükleaz) sindiriminden önce veya sonra DNA örnekleri jel elektroforezi ile ayrılır ve daha sonra kılcal etki yoluyla blotlama yoluyla bir zara aktarılır . Zar daha sonra ilgili DNA üzerindeki diziye göre bir tamamlayıcı baz dizisine sahip olan etiketli bir DNA probuna maruz bırakılır. Southern lekeleme, PCR gibi diğer tekniklerin DNA örneklerinden spesifik DNA dizilerini tespit etme kapasitesi nedeniyle laboratuvar biliminde daha az kullanılır . Bununla birlikte, bu lekeler, transgenik farelerde transgen kopya sayısının ölçülmesi veya gen nakavt embriyonik kök hücre hatlarının mühendisliği gibi bazı uygulamalar için hala kullanılmaktadır .

kuzey lekeleme

Kuzey leke diyagramı

Northern blot, bir dizi farklı RNA numunesi arasında nispi karşılaştırma olarak spesifik RNA moleküllerinin varlığını incelemek için kullanılır. Esasen denatüre edici RNA jel elektroforezi ve bir leke kombinasyonudur . Bu işlemde RNA, boyutuna göre ayrılır ve daha sonra ilgili dizinin etiketli bir tamamlayıcısı ile problanan bir zara aktarılır . Sonuçlar, kullanılan etikete bağlı olarak çeşitli yollarla görselleştirilebilir; bununla birlikte çoğu, numunede tespit edilen RNA'nın boyutlarını temsil eden bantların açığa çıkmasıyla sonuçlanır. Bu bantların yoğunluğu, analiz edilen numunelerdeki hedef RNA miktarı ile ilgilidir. Prosedür, transkripsiyon sonrası hiçbir düzenlemenin olmadığı ve mRNA seviyelerinin ilgili proteinin orantılı seviyelerini yansıttığı varsayılarak, farklı örneklerde bu RNA'nın ne kadarının mevcut olduğunu ölçerek gen ekspresyonunun ne zaman ve ne kadar meydana geldiğini incelemek için yaygın olarak kullanılır. üretilmiş. Bazı genlerin canlı dokularda ne zaman ve hangi koşullarda ifade edildiğini belirlemede en temel araçlardan biridir.

Western blotlama

Western blot, belirli proteinlerin bir protein karışımından tespit edilebildiği bir tekniktir. Western blot'lar, izole edilmiş proteinlerin boyutunu belirlemek ve ekspresyonlarını ölçmek için kullanılabilir. Western blot yönteminde, proteinler ilk olarak SDS-PAGE olarak bilinen bir teknikle iki cam plaka arasına sıkıştırılmış ince bir jel içinde boyutlarına göre ayrılır . Jeldeki proteinler daha sonra bir poliviniliden florür (PVDF), nitroselüloz, naylon veya başka bir destek membranına aktarılır. Bu zar daha sonra antikor çözeltileri ile incelenebilir . İlgili proteine ​​spesifik olarak bağlanan antikorlar daha sonra renkli ürünler, kemilüminesans veya otoradyografi dahil olmak üzere çeşitli tekniklerle görselleştirilebilir . Çoğu zaman, antikorlar enzimlerle etiketlenir. Bir kemilüminesan substrat enzime maruz kaldığında algılamaya izin verir. Western blot tekniklerinin kullanılması, yalnızca tespite değil, aynı zamanda nicel analize de izin verir. Western blot'a benzer yöntemler, canlı hücrelerde veya doku kesitlerinde spesifik proteinleri doğrudan boyamak için kullanılabilir.

Doğu lekeleme

Doğu lekeleme tekniği, proteinlerin translasyon sonrası modifikasyonunu tespit etmek için kullanılır. PVDF veya nitroselüloz membran üzerine lekelenen proteinler, spesifik substratlar kullanılarak modifikasyonlar için incelenir.

mikrodiziler

Bir DNA mikrodizisi yazdırılıyor
Prob için hedefin hibridizasyonu

Bir DNA mikrodizisi, her noktanın bir veya daha fazla tek iplikli DNA oligonükleotit fragmanı içerdiği bir mikroskop lamı gibi katı bir desteğe bağlı noktalar topluluğudur . Diziler, büyük miktarlarda çok küçük (100 mikrometre çapında) noktaları tek bir slayt üzerine yerleştirmeyi mümkün kılar. Her nokta, tek bir DNA dizisine tamamlayıcı olan bir DNA fragmanı molekülüne sahiptir . Bu tekniğin bir varyasyonu, gelişimdeki belirli bir aşamadaki bir organizmanın gen ifadesinin nitelenmesine ( ifade profili oluşturma ) izin verir. Bu teknikte bir dokudaki RNA izole edilir ve etiketli tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürülür. Bu cDNA daha sonra dizi üzerindeki fragmanlara hibritlenir ve hibridizasyonun görselleştirilmesi yapılabilir. Parçaların tam olarak aynı pozisyonu ile çoklu diziler yapılabildiğinden, bunlar, sağlıklı ve kanserli bir doku gibi iki farklı dokunun gen ekspresyonunu karşılaştırmak için özellikle yararlıdır. Ayrıca, hangi genlerin ifade edildiği ve bu ifadenin zamanla veya diğer faktörlerle nasıl değiştiği ölçülebilir. Mikrodizileri üretmenin birçok farklı yolu vardır; en yaygın olanları silikon çipler, ~100 mikrometre çapında noktalara sahip mikroskop slaytları, özel diziler ve gözenekli zarlar üzerinde daha büyük noktalara sahip dizilerdir (makrodiziler). Belirli bir dizide 100'den 10.000'e kadar herhangi bir yerde olabilir. Diziler, DNA dışındaki moleküllerle de yapılabilir.

Alel-spesifik oligonükleotit

Allel-spesifik oligonükleotid (ASO), PCR veya jel elektroforezi gerekmeden tek baz mutasyonlarının saptanmasına olanak sağlayan bir tekniktir. Kısa (20–25 nükleotid uzunluğunda), etiketli problar, parçalanmamış hedef DNA'ya maruz bırakılır, probların kısa olması nedeniyle yüksek özgüllükle hibridizasyon gerçekleşir ve tek bir baz değişikliği bile hibridizasyonu engelleyecektir. Hedef DNA daha sonra yıkanır ve hibritleşmeyen etiketli problar çıkarılır. Hedef DNA daha sonra radyoaktivite veya floresan yoluyla probun varlığı için analiz edilir. Bu deneyde, çoğu moleküler biyoloji tekniğinde olduğu gibi, başarılı deneyi sağlamak için bir kontrol kullanılmalıdır.

Moleküler biyolojide prosedürler ve teknolojiler sürekli olarak geliştirilmekte ve eski teknolojiler terk edilmektedir. Örneğin, DNA jel elektroforezinin ( agaroz veya poliakrilamid ) ortaya çıkmasından önce, DNA moleküllerinin boyutu tipik olarak sakaroz gradyanlarında hız sedimantasyonuyla belirlenir ; bu , pahalı enstrümantasyon gerektiren yavaş ve emek yoğun bir tekniktir; sakaroz gradyanlarından önce viskozimetre kullanıldı. Tarihsel ilgilerinin yanı sıra, daha yeni tekniğin uygun olmadığı başka bir yeni sorunu çözmek zaman zaman yararlı olduğundan, genellikle eski teknoloji hakkında bilgi sahibi olmaya değer.

Ayrıca bakınız

Referanslar

daha fazla okuma

Dış bağlantılar